Bilgi

Hangi genlerimin sitokin reseptörlerini kodladığını bulmak için kullanabileceğim bir veri tabanı, araç veya yöntem var mı?

Hangi genlerimin sitokin reseptörlerini kodladığını bulmak için kullanabileceğim bir veri tabanı, araç veya yöntem var mı?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Tek hücreli RNA dizi veri analizlerimden elde ettiğim 600'den fazla farklı şekilde ifade edilmiş genin bir listesine sahibim. Hangi genlerimin sitokin reseptörlerini kodladığını bulmaya devam etmek istiyorum, böylece bir ısı haritasında ekspresyonlarının kümeler arasında nasıl değiştiğini gösterebilirim. Hangi genlerimin sitokin reseptörlerini kodladığını bulmak için hangi aracı veya yöntemi kullanabileceğim konusunda bana bir ipucu verebilir mi?

Şimdiden teşekkürler.


Eminim bunu yapmanın birçok yolu vardır (PubMed aracılığıyla literatür araştırması dahil), ancak başlangıç ​​olarak, "sitokin reseptör aktivitesi" arama terimi için bir sayı içeren bunu döndüren GO terimi veri tabanını aradım. Excel dosyası olarak indirebileceğim ve R kullanarak gen setimle eşleştirebileceğim genler.


LIQA: uzun okunan izoform miktar tayini ve analizi

Uzun okuma RNA dizilimi (RNA dizilimi) teknolojileri, tam uzunluktaki transkriptleri dizileyebilir ve kısa okunan RNA dizilimi üzerinden izoforma özgü gen ekspresyonunun araştırılmasını kolaylaştırır. Uzun okuma doğrudan mRNA dizilimi veya cDNA dizilimi verilerini kullanarak izoform ifadesini ölçmek ve diferansiyel alternatif ekleme (DAS) olaylarını tespit etmek için LIQA'yı sunuyoruz. LIQA, okumalar arasında farklı ağırlıklar atamak için bir hayatta kalma modelinde temel çift kalite puanı ve izoforma özgü okuma uzunluğu bilgilerini birleştirir ve parametre tahmini için bir beklenti-maksimizasyon algoritması kullanır. LIQA'yı Evrensel İnsan Referansından, akut miyeloid lösemiden ve özofagus skuamöz epitel hücrelerinden uzun süre okunan RNA-seq verilerine uyguluyoruz ve alternatif ekleme olaylarını profillemede yüksek doğruluğunu gösteriyoruz.


Hangi genlerimin sitokin reseptörlerini kodladığını bulmak için kullanabileceğim bir veri tabanı, araç veya yöntem var mı? - Biyoloji

Birleştirilmiş genomların yapısı, derleme adları ve diğer meta veriler, istatistiksel raporlar ve genomik dizi verilerine bağlantılar hakkında bilgi sağlayan bir veritabanı.

Kültür koleksiyonları, müzeler, herbaria ve diğer doğa tarihi koleksiyonları için seçilmiş bir meta veri seti. Kayıtlar, koleksiyon kodlarını, koleksiyonların ev kurumları hakkında bilgileri ve NCBI'deki ilgili verilere bağlantılar görüntüler.

Genomik, fonksiyonel genomik ve genetik çalışmaları ve bunların ortaya çıkan veri kümelerine bağlantılar topluluğu. Bu kaynak, proje kapsamını, materyalini ve hedeflerini tanımlar ve tutarsız açıklamalar, çoklu bağımsız gönderimler ve genellikle farklı veritabanlarında depolanan çeşitli veri türlerinin çeşitli doğası nedeniyle genellikle bulunması zor olan veri kümelerini almak için bir mekanizma sağlar.

BioSample veri tabanı, deneysel analizlerde kullanılan biyolojik kaynak materyallerin tanımlarını içerir.

Sürekli olarak açıklamalı ve yüksek kalitede insan ve fare protein kodlama bölgelerinin bir çekirdek kümesini belirlemek için ortak bir çaba.

Tek nükleotid varyasyonlarını, mikro uyduları ve küçük ölçekli eklemeleri ve silmeleri içerir. dbSNP, popülasyona özgü frekans ve genotip verilerini, deneysel koşulları, moleküler bağlamı ve hem nötr varyasyonlar hem de klinik mutasyonlar için haritalama bilgilerini içerir.

NIH genetik dizi veri tabanı, halka açık tüm DNA dizilerinin açıklamalı bir koleksiyonudur. GenBank, Japonya DNA Veri Bankası (DDBJ), Avrupa Moleküler Biyoloji Laboratuvarı (EMBL) ve NCBI'deki GenBank'tan oluşan Uluslararası Nükleotid Dizisi Veritabanı İşbirliğinin bir parçasıdır. Bu üç kuruluş günlük olarak veri alışverişinde bulunur. GenBank, çoğuna Nucleotid veritabanı aracılığıyla erişilebilen birkaç bölümden oluşur. İstisnalar, sırasıyla Nucleotide EST ve Nucleotide GSS veritabanlarından erişilen EST ve GSS bölümleridir.

NIAID Grip Genom Dizileme Projesi ve GenBank'tan bir veri derlemesi. Grip dizisi analizi, açıklama ve GenBank'a gönderme için araçlar sağlar. Bu kaynak ayrıca diğer grip dizisi kaynaklarına ve grip virüsleriyle ilgili yayınlara ve genel bilgilere bağlantılar içerir.

Gıda, çevre ve hasta izolatlarından kaynaklanan bakteri patojen genomik dizilerinin toplanmasını ve analizini içeren bir proje. Halihazırda, otomatikleştirilmiş bir boru hattı, gıda kaynaklı hastalık salgınlarının araştırılmasına yardımcı olmak ve potansiyel gıda kontaminasyon kaynaklarını keşfetmek için öncelikle halk sağlığı laboratuvarları tarafından sağlanan dizileri kümeler ve tanımlar.

GenBank, RefSeq, Third Party Annotation (TPA) veri tabanı ve PDB dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan nükleotid dizileri koleksiyonu. Nükleotid Veritabanının aranması, bileşen veritabanlarının her birinden mevcut sonuçları verecektir.

Karşılaştırmalı çalışmalardan kaynaklanan ilgili DNA dizilerinin veritabanı: filogenetik, popülasyon, çevresel ve daha az derecede mutasyonel. Veritabanındaki her kayıt bir dizi DNA dizisidir. Örneğin, bir popülasyon kümesi, bir organizma içindeki genetik çeşitlilik hakkında bilgi sağlarken, bir filogenetik küme, birkaç ilgili organizmadan elde edilen tek bir genin dizilerini ve bunların hizalanmasını içerebilir.

Çok çeşitli biyomedikal araştırma uygulamalarında kullanılmak üzere tasarlanmış nükleik asit reaktiflerinin, reaktif dağıtıcıları, prob etkinliği ve hesaplanmış dizi benzerlikleri hakkında bilgilerle birlikte halka açık bir kaydı.

RefSeqGene İnsan genine özgü referans genomik dizilerin bir koleksiyonu. RefSeq geni, NCBI'nin RefSeq veritabanının bir alt kümesidir ve lokusa özgü veritabanlarının küratörlerinin ve genetik test topluluğunun incelemesine göre tanımlanır. Mutasyonları bildirmek, tutarlı intron ve ekson numaralandırma kuralları oluşturmak ve biyolojik olarak önemli diğer varyasyonların koordinatlarını tanımlamak için istikrarlı bir temel oluştururlar. RefSeqGene, Locus Reference Genomic (LRG) İşbirliğinin bir parçasıdır. Referans Dizisi (RefSeq)

NCBI tarafından üretilen küratörlü, yedekli olmayan genomik DNA, transkript (RNA) ve protein dizilerinden oluşan bir koleksiyon. RefSeq'ler, genom açıklaması, gen tanımlama ve karakterizasyonu, mutasyon ve polimorfizm analizi, ekspresyon çalışmaları ve karşılaştırmalı analizler için kararlı bir referans sağlar. RefSeq koleksiyonuna Nükleotid ve Protein veritabanlarından erişilir.

Sequence Read Archive (SRA), Roche 454 GS System®, Illumina Genome Analyzer®, Life Technologies AB SOLiD System®, Helicos Biosciences Heliscope®, Complete Genomics® ve Pacific Biosciences SMRT® dahil olmak üzere yeni nesil sıralama platformlarından sıralama verilerini depolar. .

GenBank'taki mevcut birincil dizi verilerinden oluşturulan dizileri içeren bir veritabanı. Diziler ve karşılık gelen açıklamalar deneysel olarak desteklenir ve hakemli bir bilimsel dergide yayınlanmıştır. TPA kayıtları Nükleotid Veritabanı aracılığıyla alınır.

Çeşitli büyük ölçekli dizileme projelerinden tek geçişli okumalar için DNA dizi kromatogramları (izler), temel çağrılar ve kalite tahminlerinden oluşan bir havuz.

İndirilenler

Yerel kullanım için BLAST yürütülebilir dosyaları Solaris, LINUX, Windows ve MacOSX sistemleri için sağlanmıştır. Daha fazla bilgi için ftp dizinindeki README dosyasına bakın. BLAST nükleotid, protein ve çevrilmiş aramalar için önceden biçimlendirilmiş veri tabanları da db alt dizini altında indirilebilir.

Bağımsız BLAST programlarıyla kullanım için dizi veritabanları. Bu dizindeki dosyalar, BLAST ile kullanıma hazır, önceden biçimlendirilmiş veritabanlarıdır.

Bağımsız BLAST programlarıyla kullanım için FASTA formatında dizi veritabanları. Bu veritabanları, BLAST ile kullanılmadan önce formatdb kullanılarak biçimlendirilmelidir.

Bu site, varsayılan düz dosya formatında GenBank'taki tüm dizi kayıtları için dosyalar içerir. Dosyalar GenBank bölümü tarafından düzenlenir ve tüm içeriği README.genbank dosyasında açıklanır.

Bu site, Referans Dizi (RefSeq) koleksiyonundaki tüm nükleotid ve protein dizisi kayıtlarını içerir. ""release"" dizini, tüm koleksiyonun en güncel sürümünü içerirken, seçilen organizmalar (insan, fare ve sıçan gibi) için veriler ayrı dizinlerde bulunur. Veriler FASTA ve düz dosya formatlarında mevcuttur. Ayrıntılar için README dosyasına bakın.

Bu site, gönderilen sıralama projesi tarafından düzenlenen yeni nesil sıralama verilerini içerir.

Bu site, türlere göre düzenlenmiş iz kromatogram verilerini içerir. Veriler kromatogramı, kalite puanlarını, otomatik baz çağrılarından FASTA dizilerini ve sekmeyle ayrılmış metindeki ve ayrıca XML formatlarındaki diğer yardımcı bilgileri içerir. Ayrıntılar için README dosyasına bakın.

Bu site UniVec ve UniVec_Core veritabanlarını FASTA formatında içerir. Ayrıntılar için README.uv dosyasına bakın.

Bu site, 4 haneli proje koduyla düzenlenen tüm genom pompalı tüfek dizisi verilerini içerir. Veriler, GenBank ve GenPept düz dosyalarını, kalite puanlarını ve özet istatistikleri içerir. Daha fazla bilgi için README.genbank.wgs dosyasına bakın.

Gönderiler

Araştırmacılar, konsorsiyumlar ve kuruluşlar için BiyoProjelerini kaydetmeleri için bir arayüz sağlayan çevrimiçi bir form. Bu, çalışma için genomik ve genetik verilerin sunulması için bir başlangıç ​​noktası görevi görür. Verilerin BioProject kaydı sırasında sunulmasına gerek yoktur.

Gönderim sürecini hızlı ve kolay hale getirmek için tasarlanmış, GenBank veritabanına bir veya birkaç gönderim için web tabanlı bir dizi gönderim aracı.

Tür tanımlamasında kullanım için standart bir genetik lokustan Barkod kısa nükleotid dizilerinin GenBank veri tabanına sunulması için araç.

NCBI tarafından, girişleri genel dizi veri tabanlarına (GenBank, EMBL veya DDBJ) göndermek ve güncellemek için geliştirilen bağımsız bir yazılım aracı. Tek bir kısa mRNA dizisi içeren basit gönderileri, uzun dizileri içeren karmaşık gönderileri, çoklu açıklamaları, parçalı DNA setlerini ve ayrıca filogenetik ve hizalamalı popülasyon çalışmalarından gelen dizileri işleyebilir. Basit gönderim için bunun yerine çevrimiçi gönderim aracı BankIt'ı kullanın.

Sequin ile aynı işlevlerin çoğunu kullanarak GenBank'a gönderilmek üzere dizi kayıtlarının oluşturulmasını otomatikleştiren bir komut satırı programı. Öncelikle tam genomların ve büyük dizi dizilerinin sunulması için kullanılır.

Bu bağlantı, SRA verilerini gönderenlerin verileri için nasıl güvenli bir NCBI FTP sitesi elde edebileceğini açıklar ve ayrıca izin verilen veri formatlarını ve dizin yapılarını açıklar.

Göndericilerin NCBI'deki tüm veri gönderim süreçleriyle bağlantı kurmaları ve bu süreçler hakkında bilgi bulmaları için tek bir giriş noktası. Şu anda bu, BioProjects ve BioSamples'ın kaydı ve WGS ve GTR için verilerin sunulması için bir arayüz görevi görür. Bu siteye gelecekteki eklemeler planlanmaktadır.

Bu bağlantı, izleme verilerini gönderenlerin verileri için nasıl güvenli bir NCBI FTP sitesi elde edebileceğini açıklar ve ayrıca izin verilen veri biçimlerini ve dizin yapılarını açıklar.

Aletler

Biyolojik diziler arasında yerel benzerlik bölgelerini bulur. Program, nükleotid veya protein dizilerini dizi veri tabanlarıyla karşılaştırır ve eşleşmelerin istatistiksel önemini hesaplar. BLAST, diziler arasındaki fonksiyonel ve evrimsel ilişkileri ortaya çıkarmak ve ayrıca gen ailelerinin üyelerini tanımlamaya yardımcı olmak için kullanılabilir.

Nucleotide veya Protein veritabanlarından bir GI dosyası veya erişim numaraları veya diğer Entrez veritabanlarından benzersiz tanımlayıcılar dosyası yükleyerek birçok Entrez veri tabanından kayıt almanızı sağlar. Arama sonuçları, çeşitli biçimlerde doğrudan bilgisayarınızdaki yerel bir dosyaya kaydedilebilir.

NCBI'nin Entrez sistemi içindeki verilere normal web sorgu arayüzünün dışında erişim sağlayan araçlar. Yazılım uygulamaları içinde Entrez görevlerini otomatikleştirmek için bir yöntem sağlarlar. Her yardımcı program özel bir alma görevi gerçekleştirir ve yalnızca özel olarak biçimlendirilmiş bir URL yazılarak kullanılabilir.

Bu araç, nükleotid veya protein dizilerini genomik dizi veritabanlarıyla karşılaştırır ve Temel Yerel Hizalama Arama Aracı (BLAST) algoritmasını kullanarak eşleşmelerin istatistiksel önemini hesaplar.

NCBI'nin Remap aracı, kullanıcıların açıklama verilerini yansıtmasına ve özelliklerin konumlarını bir genomik derlemeden diğerine veya baz analizi yoluyla bir baz aracılığıyla RefSeqGene dizilerine dönüştürmesine olanak tanır. Yeniden eşlemenin sıkılığını ayarlamak için seçenekler sağlanır ve özet sonuçlar web sayfasında görüntülenir. Tam sonuçlar, NCBI'nin Genome Workbench grafik görüntüleyicisinde görüntülenmek üzere indirilebilir ve yeniden eşlenen özellikler için açıklama verilerinin yanı sıra özet veriler de indirilebilir.

Sıra verilerini görüntülemek ve analiz etmek için entegre bir uygulama. Genome Workbench ile NCBI'de halka açık dizi veritabanlarındaki verileri görüntüleyebilir ve bu verileri kendi verilerinizle karıştırabilirsiniz.

Bir kullanıcının dizisindeki tüm açık okuma çerçevelerini veya zaten veritabanında bulunan bir dizideki tüm açık okuma çerçevelerini bulan bir grafik analiz aracı. On altı farklı genetik kod kullanılabilir. Çıkarsanan amino asit dizisi, çeşitli formatlarda kaydedilebilir ve BLAST kullanılarak protein veri tabanlarında aranabilir.

Primer-BLAST aracı, PCR primerlerini bir dizi şablonuna tasarlamak için Primer3'ü kullanır. Potansiyel ürünler daha sonra, amaçlanan hedefe özgüllüğü kontrol etmek için kullanıcı tarafından belirlenen veritabanlarına karşı bir BLAST aramasıyla otomatik olarak analiz edilir.

Proteinlerin genomik nükleotid dizisine hizalanmasını hesaplamak için bir yardımcı program. Needleman Wunsch küresel hizalama algoritmasının bir varyasyonuna dayanır ve özellikle intronları ve ekleme sinyallerini hesaba katar. Bu algoritma nedeniyle ProSplign, ekleme yerlerini belirlemede doğrudur ve sıralama hatalarına karşı toleranslıdır.

Bir nükleotit veya protein dizisinin ve bu diziye açıklama eklenen özelliklerin yapılandırılabilir bir grafik görüntüsünü sağlar. NCBI dizi veritabanı sayfalarında kullanıma ek olarak, bu görüntüleyici, gömülebilir bir web sayfası bileşeni olarak mevcuttur. Görüntüleyiciyi kendi sayfalarına yerleştirmek isteyen geliştiriciler için bir API Referans kılavuzu da dahil olmak üzere ayrıntılı belgeler mevcuttur.

cDNA'dan Genomik dizi hizalamalarını hesaplamak için bir yardımcı program. Needleman-Wunsch küresel hizalama algoritmasının bir varyasyonuna dayanır ve özellikle intronları ve ekleme sinyallerini hesaba katar. Bu algoritma nedeniyle Splin, ekleme yerlerini belirlemede doğrudur ve sıralama hatalarına karşı toleranslıdır.

Vektör kaynaklı olabilen bir nükleik asit dizisinin segmentlerini hızlı bir şekilde tanımlamak için bir sistem. VecScreen, yedekli olmayan özel bir vektör veritabanında (UniVec) herhangi bir diziyle eşleşen segmentler için bir sorgu dizisi arar.


ÇALIŞMA SÜRECİ

Komite, Ocak 2001'de bir ilk organizasyonel toplantı yaptı. CDC ve NIH, toplantıda komitenin sorumluluğunu sundu ve ardından komite, aşılama güvenliği endişelerinin genel bir incelemesini yaptı. Bu toplantıda komite, daha sonraki müzakerelerinde dikkate alınacak hipotezlerde nedensellik değerlendirmesi için kullanılacak temel metodolojiyi de belirlemiştir. Komitenin çalışmaları ile ilgili bilgilere halkın erişimini sağlamak ve komite ile iletişimi kolaylaştırmak için bir web sitesi (www.iom.edu/imsafety) ve bir listserv oluşturulmuştur. Komitenin şimdiye kadarki raporlarının sonuçları ve tavsiyeleri (bkz. Kutu 1) Ek A'da özetlenmiştir.

KUTU 1

Bağışıklama Güvenliği İnceleme Komitesinin Önceki Raporları. Bağışıklama Güvenliği İncelemesi: Kızamık-Kabalak-Kızamıkçık Aşısı ve Otizm (IOM, 2001a) Bağışıklama Güvenliği İncelemesi: Timerosal İçeren Aşılar ve Nörogelişimsel Bozukluklar (IOM, 2001b)

Aşılar ve otizmle ilgili soruların değerlendirilmesi için komite, Şubat 2004'te konuyla ilgili konularda sunumları dinlemek için açık bir bilimsel toplantı düzenledi (bkz. Ek B). Bu sunumların çoğu, proje web sitesinde elektronik biçimde (ses dosyaları ve slaytlar) mevcuttur. Buna ek olarak, komite, öncelikle yayınlanmış, hakemli bilimsel ve tıbbi literatürden oluşan kapsamlı bir materyal koleksiyonunu gözden geçirdi. Komite ayrıca otizm ve bağışıklık sistemi hakkında bir makale de görevlendirdi. Bu raporda belirtilmeyen birçok madde de dahil olmak üzere komite tarafından gözden geçirilen materyallerin bir listesi projenin web sitesinde bulunabilir.


Teşekkür

Vaka çalışmasını en son yöntemlerle çalışacak şekilde hata ayıklayan, güncelleyen ve test eden Leander Dony'ye özel teşekkürler. Ayrıca, vaka çalışması defterini ve müsveddeyi düzelten ve yorumları ve uzmanlıklarıyla geliştiren birçok kişiye teşekkür ederiz. Bunun için Maren Buttner, David Fischer, Alex Wolf, Lukas Simon, Luis Ospina-Forero, Sophie Tritschler, Niklas Koehler, Goekcen Eraslan, Benjamin Schubert, Meromit Singer, Dana Pe'er ve Rahul Satija'nın katkılarını kabul ediyoruz. Bunun için ayrıca makalenin isimsiz eleştirmenlerine ve editör Thomas Lemberger'e kapsamlı, yapıcı ve kapsamlı yorumları için özel teşekkürler. Vaka çalışması defteri, ilk uygulayıcılar Marius Lange, Hananeh Aliee, Subarna Palit ve Lisa Thiergart tarafından test edildi ve geliştirildi. Volker Bergen ve Alex Wolf da yetersiz uyarlamalar yaparak iş akışına katkıda bulundu. Analiz iş akışının tüm yönlerini en iyi şekilde gösterecek veri seti seçimi, Adam Haber ve Aviv Regev'den gelen türde girdilerle kolaylaştırıldı. Bu çalışma BMBF hibe# 01IS18036A ve hibe# 01IS18053A tarafından, Alman Araştırma Vakfı (DFG) tarafından İşbirlikçi Araştırma Merkezi 1243, Alt Proje A17, Helmholtz Derneği tarafından desteklenmiştir (İnkübatör hibesi seyrek2big, hibe # ZT-I-0007) ve Chan Zuckerberg Initiative DAF (Silikon Vadisi Toplum Vakfı'nın tavsiye edilen fonu, 182835) tarafından.


Bu yazıda sunulan tüm analiz kodları http://oshlacklab.com/methyl-geneset-testing/ adresinde bulunabilir. Analiz web sitesi kullanılarak oluşturulmuştur. iş akışı (1.6.2) R paketi [38]. Analiz web sitesiyle ilişkili GitHub deposu şu adrestedir: https://github.com/Oshlack/methyl-geneset-testing.

GOmeth için istatistiksel model

GOmeth ve GOregion için istatistiksel test, öğelerin yanlı olarak örneklendiği hipergeometrik dağılımın genelleştirilmiş bir versiyonu olan Wallenius'un merkezi olmayan hipergeometrik dağılımına dayanmaktadır. GOmeth için aşağıdaki adım adım prosedürü uyguluyoruz:

Her bir CpG için ben gene açıklamalı J, bir ağırlık hesapla

Her CpG tam olarak bir gene açıklamalıysa, o zaman wij = 1.

İzin vermek ben = 1, …,benJ gene açıklamalı CpG'leri belirtir J. Gen boyunca ölçülen eşdeğer CpG sayısını hesaplayın J olarak:

Çoklu gen ilişkili CpG'ler yoksa, o zaman nJ basitçe gen boyunca ölçülen prob sayısıdır J.

İzin vermek A önemli diferansiyel olarak metillenmiş Cpgs kümesini tanımlar. Her gen için J, bir gösterge vektörü tanımlayın 1J(x) uzunluk benJ öyle ki xben = 1 ise CpGijA, ve xben = 0 ise CpGijA, nerede ben = 1, …,benJ.

İzin vermek wJ ağırlık vektörünü tanımlayın wij her gen için J. Her gen için diferansiyel metilasyon skorunu hesaplayın J

maksimum değerini not edin SJ 1'dir ve SJ <1 sadece, anlamlı CpG'lerin tümünün çoklu gen ile ilişkili olduğu ve toplam ağırlıkların birden az olduğu durumlarda. SJ = 0, gen boyunca önemli diferansiyel olarak metillenmiş CpG'ler olmadığında J.

İzin vermek J = 1, …, JG gen setinde bulunan genleri ifade eder. G. Her bir gen seti için Wallenius'un merkezi olmayan hipergeometrik testi için zenginleştirme istatistiğini hesaplayın G

Standart Wallenius'un merkezi olmayan hipergeometrik testi için, zenginleştirme istatistiği, önemli diferansiyel olarak metillenmiş genler ile gen setindeki genler arasındaki kesişimdir. G, çoklu gen ile ilişkili CpG'leri yok sayar. Değiştirilmiş zenginleştirme istatistiğimiz ESG gen seti için çoklu gen ile ilişkili CpG'leri açıklar G.

1'in genin diferansiyel olarak metillendiğini ve 0'ın genin diferansiyel olarak metillenmediğini belirttiği sıralı bir ikili vektöre (ilişkili CpG'lerin sayısına dayalı olarak) hareketli bir ortalama yumuşatıcı uygulayarak olasılık ağırlıklandırma fonksiyonunu (PWF) hesaplayın. “tricubeMovingAverage” fonksiyonunu kullanıyoruz. sınır sıfır dereceli bir en küçük kareler lös eğrisine benzeyen paket. İkili vektör, her bir gen boyunca metilasyonu ölçen eşdeğer CpG'lerin sayısına göre sıralanır, nJ, küçükten büyüğe. Çıktı, girdi ile aynı uzunlukta bir vektördür, öyle ki her gene, düzleştirilmiş değere dayalı olarak bir diferansiyel metilasyon olasılığı atanır. Daha sonra her bir gen seti için beklenen zenginleştirme oranlarını hesaplıyoruz. G kümedeki genlerin ortalama PWF'sini hesaplayarak ve dizide temsil edilen diğer genlerin ortalama PWF'si ile karşılaştırarak.

Her gen setinin zenginleştirilmesini test etmek için G, aşağıdaki parametrelerle Wallenius'un merkezi olmayan hipergeometrik dağılımından tek taraflı bir p değeri elde ederiz: x = kat(ESG), m1 = gen setinin boyutu JG, m2 = dizinin geri kalanındaki gen sayısı, n = önemli genlerin toplam sayısı ve oranlar = ODDSG. kullanıyoruz ÖnyargılıUrn p değerleri elde etmek için R paketi.

Boş simülasyonlar: CpG'lerin rastgele örneklenmesi

Hem 450k hem de EPIC dizileri için Illumina dizi ek açıklamalarından rastgele 50, 100, 500, 1000, 5000 ve 10.000 CpG setleri seçtik. Örnekleme, her bir CpG set boyutu için 100 kez tekrarlandı. Standart bir hipergeometrik test (HGT), bir Wallenius'un prob numarası yanlılığını (HGT-mod) hesaba katan bir hipergeometrik testi ve Wallenius'un hipergeometrik testini temel alan ve prob sayısı ve çoklu için hesapları temel alan GOmeth kullanarak GO kategorilerinin önemli ölçüde zenginleşmesini test ettik. -gen önyargısı.

Metilasyon veri kümeleri

KIRC TCGA veri setinden [39] alınan normal örnekler, farklı gen seti test yöntemlerinin yanlış keşif oranını tahmin etmek için kullanıldı. Veriler kullanılarak indirildi küratörlüğünTCGAData Biyoiletken paket [40] ve çıkarılan 160 normal numune. Veriler önceden işlenmiş olarak sağlandı β bununla birlikte, ek filtreleme gerçekleştirdik ve düşük kaliteli probları, SNP'leri içeren probları ve ayrıca cinsiyet kromozomu problarını kaldırdık. Ortaya çıkan çok boyutlu ölçekleme çizimleri, cinsiyete veya diğer teknik etkilere dair hiçbir belirgin kanıt göstermedi (Şekil 3C).

Ek olarak, yedi gen seti test yönteminin yanlış keşif oranlarını tahmin etmek için BRCA TCGA veri setinden [41] 85 normal örnek kullanıldı. Veriler kullanılarak indirildi küratörlüğünTCGAData Biyoiletken paketi ve çıkarılan 97 normal numune. Kalite kontrolünün ardından 12 numune çıkarıldı (8'i olağandışı beta değeri dağılımlarına sahip ve 4 Afrikalı/Afrikalı Amerikalı numunesi). Düşük kaliteli problar ve SNP içeren problar filtrelenmiştir. Cinsiyet kromozomları üzerinde bulunan problar, tüm numuneler dişi olduğu için tutuldu (Ek dosya 1: Şekil S3C).

Önemli diferansiyel metilasyon olduğunda farklı gen seti test yöntemleri arasındaki performansı karşılaştırmak için akışa göre sıralanmış nötrofillerden (Neu, n = 6), monositlerden (Mono, n = 6), B oluşturulan Illumina Infinium HumanMethylationEPIC (GSE110554) verilerini kullandık. -lenfositler (B hücreleri, n = 6), CD4+ T hücreleri (CD4T, n=7, altı örnek ve bir teknik kopya), CD8+ T hücreleri (CD8T, n = 6), doğal öldürücü hücreler (NK, n = 6) ve 12 DNA yapay karışımı (MIX olarak etiketlenmiştir) [29]. Analizimizde sadece sıralanmış hücreler kullanıldı. Veriler kullanılarak indirildi deney merkezi Biyoiletken paketi.

Aynı zamanda DNA metilasyonu ve gen ekspresyonu ölçümleriyle eşleşen gelişmekte olan bir B hücresi veri setini de analiz ettik [42]. 8 bireyden insan fetal kemik iliğinden dört erken B hücresi gelişim evresi popülasyonu elde edildi. Metilasyon, Illumina HumanMethylation450 Beadchip kullanılarak ölçüldü ve gen ekspresyonu, GeneChip Human Gene 1.0 ST Dizisi (Affymetrix) kullanılarak ölçüldü. Dört popülasyon, akış sitometrisi antikorları kullanılarak tanımlandı ve Aşama 1 (ağırlıklı olarak multipotent progenitörler ve yaygın lenfoid progenitörler), Aşama 2 (BI öncesi hücreler), Aşama 3 (B-II öncesi hücreler) ve Aşama 4'ten (olgunlaşmamış B hücreleri) oluşur. ). Veriler, Gene Expression Omnibus'tan (GSE45461) indirildi.

Analiz ve işleme

Analizin çoğunluğu R (4.0.3) kullanılarak ve bazıları R (3.6.1) [43] kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Analizin farklı yönleri için kullanılan spesifik R ve paket versiyonları, bu çalışma ile ilişkili analiz web sitesinin “Oturum bilgileri” bölümlerinde görüntülenebilir: http://oshlacklab.com/methyl-geneset-testing/.

Kalite kontrol ve normalleştirme

Tüm metilasyon verileri kullanılarak işlendi. minfi [3, 44] R Bioconductor [45, 46] paketi. Dizi ve prob tipi arasında normalleştirme, tabakalı nicelik normalleştirme (SQN) yöntemi [47] kullanılarak yapıldı. Bir veya daha fazla numunede saptama P değeri >0.01 olan problar atıldı. İlgilenilen CpG'ye yakın (2 bp'ye kadar yukarı akış ve 1 akış aşağı) ortak SNP'lerden (küçük alel frekansı > 0) potansiyel olarak etkilenen problar ve spesifik olmayan problar [37, 48] ayrıca ileri analizlerden çıkarıldı.

Istatistiksel analiz

Her CpG'deki metilasyon oranı, şu şekilde temsil edilir: βmetillenmiş sinyalin toplam sinyale oranı olarak tanımlanan ve normalleştirilmiş yoğunluk değerlerinden hesaplanan değer. İstatistiksel analizler M değerleri üzerinde yapıldı ( left[M=frac sağ] ) Du ve diğerleri tarafından önerildiği gibi. [49].

Sıralanmış kan hücresi verilerini kullanan gen seti test yöntemlerinin karşılaştırılması

CpG prob bazında lineer modeller, hücre tipleri (NK'ye karşı B hücreleri, CD4'e karşı CD8 T hücreleri, monositler ve nötrofiller) arasındaki metilasyon farklılıklarını belirlemek için aşağıdakiler kullanılarak yerleştirildi: sınır paket [2]. Diferansiyel olarak metillenmiş problar (DMP'ler), ampirik Bayes moderatörlü t testleri [50] kullanılarak tanımlandı ve hiperdeğişken problara karşı koruma sağlamak için gen bazında varyanslarda güçlü ampirik Bayes büzülmesi gerçekleştirdi [51]. Ampirik Bayes moderatörlü-t p değerleri daha sonra M-değeri ölçeğinde (lfc = 0.5, |Δβ|

0.1) [30]. P değerleri, Benjamini-Hochberg prosedürü [52] kullanılarak çoklu testler için ayarlandı.

Her karşılaştırma için, GO kategorilerinin ve KEGG yollarının önemli ölçüde zenginleşmesini test ettik. Yalnızca en az 5 gen ve en fazla 5000 gen içeren kümeleri test ettik. metilGSA yöntemler. En üst sıradaki 5000 CpG, HGT ve GOmeth kullanılarak test edildi. missMetil GO terimlerinin ve KEGG yollarının zenginleştirilmesi için paket. Ham p değerleri girdi olarak aktarıldı. metilGSA yöntemler. ebGSEA yöntemleri kullanılarak çalıştırıldı. ebGSEA R paketi (https://github.com/aet21/ebGSEA).

Böbrek berrak hücreli karsinom (KIRC) verileri kullanılarak gen seti test yöntemlerinin karşılaştırılması

KIRC verileri [39] küratörlüğünTCGAData paket olarak verildi β maskelenmiş veri noktaları veri noktalarına sahip değerler, tespit p değeri 0,05'ten büyükse veya probun 10 baz çifti içinde bir SNP'ye sahip olduğu veya sorgulanan CpG'nin 15 baz çifti içinde tekrar edildiği şeklinde açıklama yapılmışsa, "NA" olarak maskelenmiştir [53]. Sadece 160 normal numuneyi çıkardık ve herhangi bir NA değerine sahip probları ve ayrıca SNP'den etkilenen probları ve daha önce açıklandığı gibi çoklu haritalama ve cinsiyet kromozomu problarını çıkardık. Bu, aşağı akış analizi için 364.602 prob bıraktı.

Normal örnekleri rastgele alt örneklere ayırarak ve bunları grup başına 5, 10, 20, 40 ve 80 örnekle iki yapay "gruba" bölerek 100 boş simülasyon çalıştırdık. 100 simülasyonun her biri için, her numune boyutunda, gruplar arasındaki DMP'ler, ampirik Bayes moderatörlü t testleri [50] kullanılarak tanımlandı ve hiperdeğişken problara karşı koruma sağlamak için gen bazında varyansların sağlam ampirik Bayes büzülmesi [51] yapıldı.

Daha sonra, farklı metilasyon analizi sonuçlarının gen seti testini, şu anda mevcut olan Broad MSigDB gen setleri ile çeşitli yöntemler kullanarak gerçekleştirdik. Şampiyon Biyoiletken paketi. GOmeth, girdi olarak hem ilk 1000 hem de ilk 5000 önemli CpG kullanılarak çalıştırıldı. NS metilGSA mGLM, mRRA (ORA) ve mRRA (GSEA) yöntemleri, minimum 5 ve maksimum 5000 gen ile sınırlandırılmış gen seti boyutları ile çalıştırıldı. ebGSEA yöntemi, varsayılan parametreler kullanılarak çalıştırıldı ve hem KPMT hem de WT çıktısı karşılaştırıldı.

Meme invaziv karsinom (BRCA) verileri kullanılarak gen seti test yöntemlerinin karşılaştırılması

KIRC verilerinde olduğu gibi, BRCA verileri [41] kullanılarak indirildi. küratörlüğünTCGAData paket. Daha sonra 97 normal numuneyi çıkardık ve herhangi bir NA değerine sahip probları ve ayrıca SNP'den etkilenen probları ve daha önce açıklandığı gibi çoklu haritalama problarını çıkardık. Tüm numune donörleri kadın olduğu için cinsiyet kromozomu probları korunmuştur. Bu, daha fazla analiz için 371.389 prob bıraktı. On iki dış numune çıkarıldı (olağandışı beta değeri dağılımlarına sahip 8'i ve 4 Afrikalı/Afrikalı Amerikalı numunesi), aşağı akış analizi için 85 numune kaldı.

Normal örnekleri rasgele alt örnekleyerek ve grup başına 5, 10, 20 ve 40 örnekle iki yapay gruba ayırarak 100 boş simülasyon çalıştırdık. İki grup arasındaki DMP'ler, KIRC verileri için tarif edildiği gibi tanımlandı, ardından daha önce ana hatları verilen yedi farklı yöntem kullanılarak aynı gen seti test yaklaşımı takip edildi.

RNA-Seq verileri ve analizi

Sıralanan kan hücresi türleri için RNA-Seq verileri SRA'dan (GSE107011 SRP125125) [31, 32] indirilmiştir. Okumalar hg19 referans transkriptomuna eşlendi (http://refgenomes.databio.org/v2/asset/hg19_cdna/fasta/archive?tag=default) ve Somon (1.2.1) [54] kullanılarak nicelleştirildi. Somon transkript-seviyesi tahminleri ithal edildi ve gen seviyesinde, uzunluk ölçekli TPM olarak özetlendi. tximport Biyoiletken paketi [55]. Düşük düzeyde eksprese edilen genler, kullanılarak filtrelendi. kenarR [56] Chen tarafından ark. [57]'de açıklandığı gibi “filterByExpr” işlevi.. Daha sonra veriler TMM normalleştirildi [58] ve “voom” [60] gözlemsel-birleştirerek gücü artırmak için “voomWithQualityWeights” [59] kullanılarak dönüştürüldü. numuneye özgü ağırlıklarla seviye ağırlıkları.

Daha sonra, hücre tipleri (B hücreleri vs NK hücreleri, CD4 - CD8 T hücreleri, monositler vs nötrofiller) arasındaki gen ekspresyon farklılıklarını belirlemek için her bir gen için prob-akıllı doğrusal modeller yerleştirildi. sınır [2]. Diferansiyel olarak eksprese edilen genler, ampirik Bayes moderatörlü t testleri [50] kullanılarak tanımlandı ve hiperdeğişken problara karşı koruma sağlamak için gen bazında varyanslarda güçlü ampirik Bayes büzülmesini gerçekleştirdi [51]. P değerleri, Benjamini-Hochberg prosedürü [52] kullanılarak çoklu testler için ayarlandı.

goana fonksiyonunu kullandık. sınır GO kategorilerinin zenginleştirilmesini test etmek için paket, KEGG yollarının zenginleşmesini test etmek için kegga ve Geniş MSigDB gen setlerinin zenginleştirilmesini test etmek için genelleştirilmiş bir goana ve kegga versiyonu. Tüm yöntemler gen uzunluğu yanlılığını hesaba kattı [23]. GO, KEGG ve MSigDB doğruluk kümeleri daha sonra RNA-Seq analizinden her hücre tipi karşılaştırması için ilk 100 zenginleştirilmiş küme olarak tanımlandı.

Affymetrix dizisi gen ifadesi verileri ve analizi

Pre-B hücre gelişimi için Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array gen ekspresyon verileri GEO'dan (GSE45460) indirilmiştir [42].

Ham CEL dosyaları, kullanılarak yüklendi ve işlendi. oligo Biyoiletken paketi. Veriler arka plan düzeltildi, normalleştirildi ve Robust Multichip Average (RMA) ön işleme kullanılarak özetlendi [33, 34]. Yalnızca en az 7 numunede medyan yoğunluğu 4,5'ten büyük olan problar tutuldu. Birden fazla Entrez tanımlayıcısıyla eşlenen transkript-küme tanımlayıcıları, Entrez tanımlayıcılarıyla eşleşmeyen tüm problarla birlikte filtrelendi ve akış aşağı analiz için 19.494 gen bırakıldı.

Daha sonra, ön B hücre gelişiminin Aşama 1 ve Aşama 2 (Aşama 1 ve Aşama 2) arasındaki gen ekspresyonu farklılıklarını belirlemek için her bir gen için prob bazında doğrusal modeller yerleştirildi. sınır [2]. Diferansiyel olarak eksprese edilen genler, ampirik Bayes moderatörlü t testleri [50] kullanılarak tanımlandı ve hiperdeğişken problara karşı koruma sağlamak için gen bazında varyanslarda güçlü ampirik Bayes büzülmesini gerçekleştirdi [51]. P değerleri, Benjamini-Hochberg prosedürü [52] kullanılarak çoklu testler için ayarlandı. Günlüğü olan genler2 TREAT [30] kullanılarak 0,5'ten büyük kat değişimi ve 0,05'ten düşük FDR'nin diferansiyel olarak ifade edildiği kabul edildi.

gelen goana işlevi sınır GO kategorilerinin zenginleştirilmesini test etmek için paket ve KEGG yollarının zenginleştirilmesini test etmek için kegga kullanıldı. GO ve KEGG doğruluk kümeleri daha sonra gen ekspresyonu analizinden Aşama 1 ile Aşama 2 karşılaştırması için ilk 100 zenginleştirilmiş küme olarak tanımlandı.

Akışa göre sıralanmış kan hücresi verileri kullanılarak GOregion'ın değerlendirilmesi

Akışa göre sıralanmış kan hücrelerinden oluşturulan lllumina Infinium HumanMethylationEPIC (GSE110554) verileri, DMR'lerin tanımlanması için kullanıldı. Veriler daha önce açıklandığı gibi işlendi. Hücre tipleri arasındaki DMR'ler (B hücreleri vs NK hücreleri, CD4 vs CD8 T hücreleri, monositler vs nötrofiller) kullanılarak tanımlandı. DMRkat Biyoiletken paketi [16]. Analiz, varsayılan parametreler kullanılarak M değerleri üzerinde yapıldı. Aşağı akış gen seti testi, ortalama |Δβ| ≥ 0.1 ve en az 3 temel CpG.

GO terimleri, goana işlevinde uygulandığı gibi goregion ve standart bir HGT kullanılarak DMR ile ilişkili genlerin zenginleştirilmesi için test edildi. sınır Biyoiletken paketi. Bir gen, tanımlandığı gibi TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGen Bioconductor paketi, bir DMR ile en az 1 bp örtüşüyorsa goana kullanılarak test edilecek genler listesine dahil edildi.

B-öncesi hücre geliştirme verileri kullanılarak GOregion'ın değerlendirilmesi

Ön B hücre gelişiminin 4 aşamasından oluşturulan lllumina Infinium HumanMethylation450 (GSE45459) verileri, DMR'lerin tanımlanması için kullanıldı. Veriler daha önce açıklandığı gibi işlendi. Aşama 1 ve Aşama 2 arasındaki DMR'ler, DMRkat Biyoiletken paketi [16]. Analiz, varsayılan parametreler kullanılarak M değerleri üzerinde yapıldı. DMR'ler, gen seti testinden önce filtrelenmedi.

GO terimleri, daha önce sıralanmış kan hücresi verileri için tarif edildiği gibi goregion ve standart bir HGT kullanılarak DMR ile ilişkili genlerin zenginleştirilmesi için test edildi.


Biyoteknoloji Denetim Kılavuzu (11/91)

Not: Bu belge, araştırmacılar ve diğer FDA personeli için referans materyalidir. Belge FDA'yı bağlamaz ve herhangi bir kişi(ler) için herhangi bir hak, ayrıcalık, fayda veya dokunulmazlık sağlamaz.

TEŞEKKÜRLER

Bu Kılavuz, Saha Araştırmaları Birimi (DFI) Direktörü Robert C. Fish tarafından başlatılmıştır. Bay Fish, Barbara-Helene mith, Ph.D., DIB, CHI-DO'dan, biyoteknoloji alanında Araştırmacılar için teftiş kılavuzları geliştirmek üzere bir çalışma grubuna başkanlık etmesini istedi. Thaddeus T. Sze, Ph.D., Kimya Mühendisi, DFI ve Kim A. Rice, Supervisory Investigator, SEA-DO'nun da yer aldığı çalışma grubu, FDA Merkezi ve aktif olarak görev yapan Saha personelinden elde edilen bilgilerle bir taslak belge hazırladı. biyoteknoloji denetimlerinde yer almaktadır.

Belge, aşağıdaki Merkez ve Saha personelinin katıldığı 2 l/2 günlük bir çalıştayda (29-3l, l99l) gözden geçirildi ve genişletildi: Wendy Aaronson (CBER), Henry Avallone (NWK-DO), Yuan-Yuan Chiu , Doktora (CDER), Vitolis Vegris, D.V.M., Ph.D. (CVM), John Ingalls (BOS-DO), Rita Jhangiani (PHI-DO), George Kroehling (CDRH), Seth Pauker, Ph.D. (OB), Pearl Tanjuaquio (LOS-DO), Frank Twardochleb (CDRH) ve Sylvia Yetts (DAL-DO).

Denetim raporlarını ve FDA-483'leri paylaşan, teknik uzmanlığa katkıda bulunan, yorumlarda bulunan ve bu Kılavuzun hazırlanmasında yardımcı olan herkese minnettarlığımızı ifade etmek isteriz. Uzman büro yardımı için Bayan Kimberly Search'e (DFI) özel teşekkürler.

İÇİNDEKİLER

ARAŞTIRMACILAR İÇİN BİYOTEKNOLOJİ DENETLEME KILAVUZU

GİRİŞ

"Biyolojik sistemlerin ve organizmaların teknik ve endüstriyel süreçlere uygulanması" olarak tanımlanan biyoteknoloji yeni değildir. Tahılı alkole fermente etmek için maya kullanımı yüzyıllardır devam etmektedir. Benzer şekilde, çiftçiler ve yetiştiriciler, bitkilerde ve hayvanlarda arzu edilen özellikleri seçerek daha iyi mahsul ve stok üretmek için bir tür "genetik mühendisliği" kullanırlar. Ancak son zamanlarda "yeni" biyoteknoloji teknikleri, bilim adamlarının bir organizmanın genetik materyalini hücresel veya moleküler düzeyde değiştirmesini sağladı. Bu yöntemler daha kesindir, ancak sonuçlar tüm organizmaları içeren klasik genetik tekniklerle üretilenlere benzer. Bu Kılavuzda kullanılan biyoteknolojiden türetilen ürünler (BDP), yeni biyoteknoloji tekniklerinden türetilen ürünlere atıfta bulunmaktadır.

BDP'nin geliştirilmesi ve bu ürünlerin imalatının ve kontrolünün denetlenmesi birçok zorluğu beraberinde getiriyor. Sürekli olarak geliştirilmekte olan çeşitlendirilmiş üretim ve kontrol süreçleri nedeniyle, bu operasyonları denetlemek için bir teknik yeterlilik düzeyine ulaşmak için büyük çaba gerekmektedir. Teknoloji seviyesi artmakla birlikte, biyoteknik olarak türetilen maddelerin ve cihazların üretimi ve kontrolü için "geleneksel" olarak üretilmiş ürünler için geçerli olan aynı temel düzenlemeler ve gereksinimlerin geçerli olduğu kabul edilmelidir.

Aynı kriterler, antibiyotik, enzim ve insülin, heparin ve albümin dahil olmak üzere diğer yüksek moleküler ağırlıklı maddelerin üreticilerinin denetiminde uzun yıllardır kullanılmaktadır. Bu Kılavuz, BDP üreticilerinin denetimleri sırasında tespit edilen bazı temel sorunları ele alacaktır. Üretim sistemleri arasında hayvanlar, hücre klonları (örneğin hibridomlar), memeli ve böcek hücre kültürleri, maya ve bakteriler veya bu sistemlerin kombinasyonları yer alabilir.

Denetimin temel amacı, üreticinin kontrollü bir durumda ve yasalara ve düzenlemelere uygun olarak çalışıp çalışmadığını belirlemektir. Firmanın kalite taahhüdü, üretilmekte olan şirket veya ürün türünden bağımsız olarak hayati önem taşımaktadır.

Denetimin önemli bir yönü, kusurlu ürünü, uygun olmayan ürünü ve sistem arızalarını belirlemektir. Şirketlerin sakıncalı koşulları ve eksik üretim ve kontrol sistemlerini araştırma ve düzeltme şekli, denetimin önemli bir parçasıdır ve tipik olarak bir firma içindeki kalite seviyesini gösterir.

İnsan ve veteriner ilaçları ve cihazlarının ön onay denetimlerinde olduğu gibi, biyoteknoloji firmalarının denetimlerinin ekipler tarafından yürütülmesi ve denetimin genel yürütülmesinden baş Araştırmacının sorumlu olması tavsiye edilir. Analistler (Kimyagerler ve/veya Mikrobiyologlar), Bilgisayar Uzmanları ve Mühendisler incelemenin tamamına veya bir kısmına katılabilir. Denetimden önce, "ekip" belirli ekip üyelerinin görevlerini tartışmalıdır.

Biyoteknoloji denetimi aynı zamanda ürüne özel bir denetimdir. Herhangi bir incelemede olduğu gibi, kapsam genellikle bir denetimdir ve her şeyi kapsamaz. Bu nedenle, tüm sistemler, süreçler, kontroller ve test prosedürleri için doğrulama verileri gözden geçirilemez. Bununla birlikte, birkaç sistem veya kontrole özel ayrıntılı kapsam verilmelidir. Başvuru belgesinden veya firmadan bir akış şeması muayeneden önce veya muayenede alınmalı ve spesifik üretim adımları üreticinin sorumlu personeli ile gözden geçirilmelidir.

HÜCRE KÜLTÜRÜ VE FERMENTASYONU

    Ana Hücre Bankası ve Çalışan Hücre Bankası

BDP üretimi için başlangıç ​​materyali, ilgili protein ürününü veya monoklonal antikoru ifade eden bakteri, maya, böcek veya memeli hücre kültürünü içerir. Hücre tohum partisi sistemi, üreticiler tarafından başlangıç ​​hammaddesinin kimliğini ve saflığını sağlamak için kullanılır. Bir hücre tohum partisi, tek bir kültürün alikotlarından oluşur. Ana hücre bankası (MCB), tek bir koloniden (bakteri, maya) veya tek bir ökaryotik hücreden türetilir, genetik stabiliteyi sağlamak için kriyojenik olarak depolanır ve çalışan hücre bankası (WCB) için kaynak materyal sağlamak için yeterli kültür ampulünden oluşur. . WCB, MCB'nin bir veya daha fazla ampulünden türetilen, kriyojenik olarak depolanan ve üretim partisini başlatmak için kullanılan bir hücre miktarı olarak tanımlanır.

Depolama ve çoğaltma sırasında hücre bankasının genetik stabilitesi büyük bir endişe olduğundan, hem MCB hem de WCB'nin kökenini ve geçmişini (geçit sayısı) bilmek önemlidir. Bir MCB ampulü dondurulur veya liyofilize edilir ve yalnızca bir kez kullanılır. Bazen, bir WCB'den yeni bir MCB üretilebilir. Yeni MCB test edilmeli ve uygun şekilde karakterize edilmelidir. Biyolojik ürünler için, bir WCB'den yeni bir MCB oluşturulmadan önce bir ürün lisans başvurusu veya değişikliği sunulmalı ve onaylanmalıdır.

Ekspresyon vektörünün yapısı, istenen ürünü kodlayan genetik materyali içeren fragman ve konak hücrenin/hücrelerin ilgili genotipi ve fenotipi hakkında bilgiler bir ürün başvurusunun parçası olarak sunulur. Biyolojik sistemlerin başlıca endişeleri, üretim ve depolama sırasında hücre bankalarının genetik stabilitesi, kontamine mikroorganizmalar ve bazı memeli hücre dizilerinde endojen virüslerin varlığıdır. Başvuru belgesinin bir parçası olarak, üreticiler bir hücre bankasını karakterize etmek ve nitelendirmek için gerçekleştirilen tüm testlerin bir tanımını sunacaktır.

Bir hücre bankasını karakterize etmek için gereken testlerin, nihai ürünün kullanım amacına, konakçı/ekspresyon sistemine ve ürünün saflaştırılması için kullanılan teknikleri içeren üretim yöntemine bağlı olacağı vurgulanmalıdır. Ayrıca, teknoloji ilerledikçe test türleri de değişebilir.

MCB titizlikle test edilmiştir. Aşağıdaki testler genellikle gerçekleştirilir, ancak bunlarla sınırlı değildir:

  1. DNA parmak izi ile genotipik karakterizasyon
  2. Besin gereksinimleri, izoenzim analizi, büyüme ve morfolojik özellikler ile fenotipik karakterizasyon
  3. İstenilen ürünün tekrarlanabilir üretimi
  4. Vektör/klonlanmış fragmanın kısıtlama enzim haritalaması ile moleküler karakterizasyonu, dizi analizi
  5. Viral kontaminasyonu tespit etmek için testler
  6. Retrovirüsleri tespit etmek için ters transkriptaz tahlili
  7. Diğer mikrobiyal kirleticileri tespit etmek için sterilite testi ve mikoplazma testi

WCB'yi MCB kadar kapsamlı bir şekilde test etmek gerekli değildir, ancak bir WCB'nin sınırlı karakterizasyonu gereklidir. WCB'de genellikle aşağıdaki testler yapılır, ancak bu liste şunları kapsamaz:

  1. fenotipik karakterizasyon
  2. Kısıtlama enzim haritalaması
  3. Sterilite ve mikoplazma testi
  4. İstenilen ürünün tekrarlanabilir üretiminin test edilmesi

MCB ve WCB, genetik stabiliteyi sağlayan koşullarda saklanmalıdır. Genellikle sıvı nitrojen veya buhar fazında depolanan hücreler -70 C'de depolanan hücrelere göre daha uzun süre stabildir. Ayrıca, bir dondurucunun arızalanması durumunda MCB ve WCB'nin birden fazla yerde saklanması önerilir.

  1. Yazılı prosedürlerin başvuru belgesinde sunulanları doğru bir şekilde yansıttığını doğrulayın. B. Parti kayıtlarının yazılı prosedürleri takip ettiğini belirleyin. C. MCB/WCB'nin kimliğini ve izlenebilirliğini belirleyin. NS. Her bir konumdaki saklama koşullarını kontrol edin. e. MCB ve WCB'ye erişilebilirliği kontrol edin. Güvenlik önlemleri ve sorumluluk günlükleri olup olmadığını belirleyin. F. Tüm spesifikasyonları karşılamayan MCB/WCB örneklerini, özellikle de kullanım için serbest bırakılmışlarsa belgeleyin.

Ortamı hazırlamak için kullanılan hammaddeler, istenen ürünü üreten organizmalar için uygun büyüme oranını ve gerekli besin maddelerini sağlayacak şekilde dikkatlice seçilmelidir. Hammaddeler, hücre kültürü, fermantasyon ve saflaştırma işlemi yoluyla bitmiş ürüne taşınabilecek istenmeyen ve toksik bileşenleri içermemelidir. Su, ortamın önemli bir bileşenidir ve suyun kalitesi, kullanılan rekombinant sisteme, üretim aşamasına ve ürünün kullanım amacına bağlı olacaktır. Farklı bir satıcı tarafından tedarik edildiğinde benzer olduğu düşünülen hammaddeler, kullanımdan önce kabul kriterlerini karşılamalıdır. Ek olarak, büyüme parametrelerinin, verimin ve nihai ürün saflaştırmasının aynı kalmasını sağlamak için farklı bir satıcıdan hammaddeler kullanıldığında küçük ölçekli bir pilot çalıştırmanın ardından tam ölçekli bir üretim çalıştırması önerilir.

Çoğu memeli hücre kültürü, büyüme için serum gerektirir. Serum sıklıkla, tesadüfi organizmalar, özellikle mikoplazma tarafından bir kontaminasyon kaynağıdır ve firmalar serumun sterilliğini sağlamak için önlemler almalıdır. Bazı Brezilya sığır serumu (BBS) tırnak ve ağız hastalığı ile kontamine olmuştur. Ayrıca serumun gerçekten de sığır serumu olduğundan ve insan kaynaklarından elde edilmediğinden emin olun.

Sığır serumunun sığır süngerimsi ensefalopati (BSE) ajanı ile kontamine olabileceğine dair ek bir endişe vardır. BSE, Birleşik Krallık'tan sürülerde tespit edilen yavaş bir hastalıktır. Bu ajanın varlığını tespit etmek için hassas bir in vitro test olmadığından, üreticilerin serumun kaynağını bilmesi ve serumun BSE'nin endemik olduğu bölgelerden gelmediğine dair sertifika talep etmesi önemlidir. BSE'nin diğer potansiyel kaynakları, sığır kaynaklarından türetilen proteazlar ve diğer enzimler olabilir. Biyolojik ürün üreticilerinden imalatta kullanılan bu malzemelerin menşeini belirlemeleri istenmiştir.

Kullanılan ortam sterilize edilmelidir. Genellikle yerinde sterilize (SIP) veya sürekli sterilizasyon sistemi (CSS) işlemi kullanılır. Bu noktanın ötesinde eklenen herhangi bir besin maddesi veya kimyasal madde steril olmalıdır. Hava hatlarında steril filtreler bulunmalıdır.

  1. Serumun kaynağını belirleyin.
  2. Medyanın steril olmasını sağlamak için sterilizasyon döngüsünün uygun şekilde doğrulandığını onaylayın.
  3. Tüm hammaddelerin kalite kontrol ile test edildiğini doğrulayın. Tüm sığır materyalinin kökenini belirleyin.
  4. Ortamın tüm özellikleri karşılamadığı durumları belgeleyin.
  5. Son kullanma tarihi geçmiş hammaddelerin üretimde kullanılmadığını doğrulayın.
  6. Medya ve diğer katkı maddelerinin uygun şekilde saklandığını kontrol edin.

Biyoreaktör aşılama, transfer ve hasat işlemleri, onaylanmış aseptik teknikler kullanılarak yapılmalıdır. Endüstriyel biyoreaktörlerden eklemeler veya çıkarmalar genellikle buharla sterilize edilmiş hatlar ve buhar kilitli tertibatlar aracılığıyla yapılır. Hattın veya biyoreaktör kap duvarının ısıtılmasının kültüre zararlı olmayacağı durumlarda buhar açık bırakılabilir.

İstenen ürünün doğru ve verimli ifadesini elde etmek için bir biyoreaktör sisteminin yakından izlenmesi ve sıkı bir şekilde kontrol edilmesi önemlidir. Fermantasyon süreci için parametreler belirlenmeli ve izlenmelidir. Bunlar şunları içerebilir: büyüme hızı, pH, atık yan ürün seviyesi, viskozite, kimyasalların eklenmesi, yoğunluk, karıştırma, havalandırma, köpürme vb. Bitmiş ürünü etkileyebilecek diğer faktörler arasında kesme kuvvetleri, işlemden kaynaklanan ısı ve contaların etkinliği yer alır. ve contalar.

Birçok büyüme parametresi protein üretimini etkileyebilir. Bu faktörlerin bazıları deamidasyonu, izopeptid oluşumunu veya konak hücre proteolitik işlemesini etkileyebilir. Besin-eksik ortam belirli durumlarda bir seçim mekanizması olarak kullanılsa da, belirli amino asitlerde eksik ortam ikamelere neden olabilir. Örneğin, E. coli büyürken metiyonin ve/veya lösinden yoksun kaldığında, organizma norlösini sentezleyecek ve onu normal olarak metionin tarafından işgal edilen bir pozisyona dahil ederek vahşi tip proteinin bir analogunu verecektir. Bu yakından ilişkili ürünlerin mevcudiyetini kromatografik olarak ayırmak zor olacaktır, bunun hem salım spesifikasyonlarının uygulanması hem de ürün saflaştırma işleminin etkinliği üzerinde etkileri olabilir.

Fermantasyon, veri kaydı ve veri azaltma ve analiz sürecini kontrol etmek için kullanılan bilgisayar programları doğrulanmalıdır.

Rekombinant mikroorganizmalar için tasarlanmış biyoreaktör sistemleri, yalnızca saf bir kültürün korunmasını değil, aynı zamanda kültürün sistemler içinde bulunmasını da gerektirir. Muhafaza, laboratuvar ortamı dışında daha az hayatta kalabilen bir konak-vektör sisteminin uygun seçimiyle ve gerekli görüldüğünde fiziksel yollarla sağlanabilir.

NIH Yönergeleri Ek K'nin Revizyonu (1991), rekombinant DNA'dan türetilen endüstriyel mikroorganizmaları içeren büyük ölçekli deneylerin yürütülmesi için uygun muhafaza uygulamalarının ve tesislerinin resmileştirilmesini yansıtır. Ek K, araştırma veya üretimde 10 litreyi aşan miktarlar söz konusu olduğunda, Ek G'nin bölümlerinin yerini alır. Büyük ölçekli araştırma veya üretim için dört fiziksel koruma düzeyi belirlenir: GLSP, BL1-LS,BL2-LS ve BL3-LS.

(İyi Büyük Ölçekli Uygulama) seviyesi, uzun bir geçmişe veya güvenli büyük ölçekli kullanıma sahip konakçı organizmalardan türetilen canlı, patojenik olmayan ve toksik olmayan rekombinant suşları içeren geniş ölçekli üretim araştırmaları için önerilir. GLSP fiziksel muhafaza düzeyi, büyük ölçekli ortamlarda optimum büyümeye izin veren, ancak çevrede olumsuz sonuçlar olmadan sınırlı hayatta kalmaya izin veren yerleşik çevresel sınırlamalara sahip organizmalar gibi organizmalar için önerilir.

(Biyogüvenlik Düzeyi 1 - Büyük Ölçekli) fiziksel koruma düzeyi, laboratuvar ölçeğinde BL1 kapsamı gerektiren rekombinant DNA molekülleri içeren canlı organizmaların büyük ölçekli araştırmaları veya üretimi için önerilir.

Laboratuvar ölçeğinde BL2 muhafazası gerektiren rekombinant DNA molekülleri içeren canlı organizmaların büyük ölçekli araştırmaları veya üretimi için fiziksel muhafaza seviyesi gereklidir.

Laboratuvar ölçeğinde BL3 muhafazası gerektiren rekombinant DNA molekülleri içeren canlı organizmaların büyük ölçekli araştırmaları veya üretimi için fiziksel muhafaza seviyesi gereklidir.

Laboratuar ölçeğinde BL4 muhafazası gerektiren rekombinant DNA molekülleri içeren canlı organizmaların büyük ölçekli araştırmaları veya üretimi için şu anda herhangi bir hüküm yoktur.

Hücre büyümesi sırasında sistemde tesadüfi organizmalar olmamalıdır. Biyoreaktördeki kirletici organizmalar, hem ürün verimini hem de aşağı akış sürecinin istenen proteini doğru şekilde ayırma ve saflaştırma yeteneğini olumsuz etkileyebilir. Biyoreaktörde kirletici organizmaların varlığı veya etkileri, büyüme hızı, kültür saflığı, bakteriyofaj tahlili ve yağ asidi profili gibi çeşitli yollarla tespit edilebilir.

  1. Rastgele ajanların bulunmadığından emin olmak için yazılı prosedürler ve kontamine çalışmaları reddetmek için oluşturulmuş kriterler olduğunu doğrulayın.
  2. Hücre büyüme kayıtlarını gözden geçirin ve üretim çalıştırma parametrelerinin belirlenen modelle tutarlı olduğunu doğrulayın. C. Büyüme parametrelerinin belirlenen sınırları aşması durumunda hangi araştırmaların ve düzeltici faaliyetlerin gerçekleştirileceğini belirlemek için yazılı prosedürleri gözden geçirin.
  3. Büyüme parametrelerinin belirlenen sınırları aşması durumunda hangi araştırmaların ve düzeltici faaliyetlerin gerçekleştirileceğini belirlemek için yazılı prosedürleri gözden geçirin.
  4. Hücre in5 sırasında uygun aseptik teknikleri sağlayın. Muayene Yaklaşımı:
  5. Daha fazla işlemeden önce uygun süreç içi kontrollerin kullanıldığını belirleyin.

ASİT ÜRETİMİ

Monoklonal antikorlar, hücre kültüründe veya bir farenin karnında üretilebilir. Ascites üretiminde incelenmesi gereken benzersiz kritik noktalar vardır.

    fare kolonisi
      Fare Kolonisinin Karakterizasyonu ve Kontrolü

    Assit üretmek için kullanılan fare kolonisinin karakterizasyonu ve kontrolü çok önemlidir. Farenin türü, kaynağı, satıcısı ve koloninin viral hastalıktan ari olduğuna dair sertifika kaydedilmelidir. Farelerin sağlıklı kalmasını ve tüm kabul kriterlerini karşılamasını sağlamak için üretimde kullanılan hayvanlar karantinaya alınmalı ve bir hafta boyunca her gün kontrol edilmelidir. Fareler üretim sırasında günlük olarak gözlemlenmelidir. Karantina ve üretim sırasında açıkça sağlıklı kalmayan herhangi bir fareyi çıkarmak için katı SÇP'ler olmalıdır.

    Farelerin hastalıktan, özellikle de kolonileri yaygın olarak enfekte eden virüslerden uzak kalmasını sağlamak için hayvan barınaklarına çok dikkat edilmelidir. Farklı odalarda barınan kolonilerin kontaminasyonunu önlemek için, başka bir odaya girmeden önce bu eşyaların değiştirilebilmesi için kişilerin tek kullanımlık eldiven, laboratuvar önlüğü, baş örtüsü ve patik giymeleri iyi bir fikirdir. Hayvan barınakları ve kafesleri sıhhi koşullarda tutulmalıdır.

    Tek tek fareler tanımlanmalıdır, böylece bir fareye kaç kez dokunulduğuna dair bir kayıt ve her bir dokunuştan elde edilen sıvı miktarı doğru bir şekilde muhafaza edilebilir.

    Farelerin enjeksiyonu ve asit sıvısının çıkarılması, tek yönlü bir başlık altında veya fareleri bulaşıcı ajanlardan koruyacak bir istasyon gibi temiz bir ortamda yapılmalıdır. Kılavuz çekme işlemini açıklayan yazılı prosedürler olmalıdır. Diğer farelerden enfeksiyon bulaşma olasılığını önlemek için her fare için farklı bir iğne önerilir. Çapraz kontaminasyonu önlemek için biyolojik olarak tehlikeli muhafazaya sıkı sıkıya bağlı kalarak iğneleri işlemek için de yazılı prosedürler olmalıdır.

    Ayrıca, işlemden önce saklama sıcaklıklarını ve koşullarını açıklayan yazılı prosedürler bulunmalıdır. Bu, toplama ve işleme konusunda bir zaman sınırlaması oluşturmayı içerecektir. Asitlerin havuzlanması kabul edilebilir, ancak bir havuzun nasıl yapıldığını (bir havuzu kaç tane ve hangi farelerin oluşturduğunu) açıklayan yazılı prosedürler olmalı ve kayıtlar havuzu neyin oluşturduğunu doğru bir şekilde yansıtmalıdır. Bu nedenle, bir hayvanın enfekte olduğu keşfedilirse, kayıtlar, enfekte hayvanın asit sıvısını hangi havuzda içerdiğini yansıtacaktır.

    Pristan bazen fareleri hazırlamak ve asit üretimini arttırmak için kullanılır. Parenteral ürünler için firma, saflaştırma işleminin pristanı çıkaracağını göstermelidir. Bu, in vitro teşhis cihazlarında kullanılan ürünler için bir endişe kaynağı olmamalıdır.

    1. Farelerin karantinaya alınması ve kabul edilmesi, farelerin barındırılması ve bakımı, farelerin tanımlanması, koloninin viral enfeksiyonunu önlemek için temiz bir ortamın sürdürülmesi, sağlıksız farelerin bertaraf edilmesi ve asit sıvısının işlenmesi için yeterli kontrolleri sağlamak için SOP'leri gözden geçirin.
    2. Hayvanların sağlığının iyi olduğundan ve karantina süresi ve üretim sırasında günlük olarak gözlemlendiğinden emin olmak için kayıtları gözden geçirin.
    3. Kalifiye bir hayvan bakım personelinin varlığını doğrulayın.

    EKSİME, İZOLASYON VE ARITMA

    Fermantasyon işlemi tamamlandıktan sonra, istenen ürün ayrılır ve gerekirse konfigürasyon bütünlüğünü yeniden sağlamak için yeniden katlanır ve saflaştırılır. Hücre içi proteinlerin geri kazanılması için hücrelerin fermantasyondan sonra parçalanması gerekir. Bu kimyasal, enzimatik veya fiziksel yöntemlerle yapılır. Bozulmayı takiben, hücresel kalıntılar santrifüjleme veya filtrasyon yoluyla uzaklaştırılabilir. Hücre dışı proteinin geri kazanılması için, ürünün üretici organizmalardan birincil olarak ayrılması, santrifüjleme veya membran filtrasyonu ile gerçekleştirilir. Amonyum sülfat çökeltme ve sulu iki fazlı ayırma gibi başlangıç ​​ayırma yöntemleri, ürünleri konsantre etmek için santrifüjlemenin ardından kullanılabilir. Daha ileri saflaştırma adımları, öncelikle safsızlıkları gidermek ve ürünü nihai spesifikasyonlara yaklaştırmak için kromatografik yöntemleri içerir.

    1. Ekstraksiyon ve İzolasyon
      1. Filtrasyon -Ultrafiltrasyon, istenen ürünü hücre döküntülerinden çıkarmak için yaygın olarak kullanılır. Membran filtrenin gözenekliliği, belirli bir moleküler ağırlığa kalibre edilir ve bu ağırlığın altındaki moleküllerin geçmesine izin verirken, bu ağırlığın üzerindeki molekülleri tutar.
      2. Santrifüj - Santrifüj açık veya kapalı olabilir. Açık santrifüjleme için ortamın yeterliliği değerlendirilmelidir.
      1. Afinite kromatografisi
      2. İyon Değişim Kromatografisi (IEC)
      3. jel filtrasyonu
      4. Hidrofobik Etkileşim Kromatografisi (HIC)
      5. Ters Fazlı HPLC

      Tüm ayırma ve saflaştırma adımları ayrıntılı olarak tanımlanmalı ve akış şemaları ile sunulmalıdır. Tüm ekipman, kolonlar, reaktifler, tamponlar ve beklenen verimler için yeterli açıklamalar ve spesifikasyonlar sağlanmalıdır. Uygulanabilir olduğunda, yazılı prosedürler Kuruma sunulan başvuru belgeleri ile karşılaştırılmalıdır. Proses içi saklama koşulları ve kalite kontrol testleri gözden geçirilmelidir.

      FDA, Mayıs 1987'de "Proses Validasyonuna İlişkin Genel İlkeler Rehberi"nde proses validasyonunu şu şekilde tanımlamıştır:

      Validasyon - belirli bir prosesin, önceden belirlenmiş spesifikasyonları ve kalite özelliklerini karşılayan bir ürünü tutarlı bir şekilde üreteceğine dair yüksek derecede güvence sağlayan belgelenmiş kanıtların oluşturulması.

      Süreci haklı çıkaran ve sürecin tutarlı bir şekilde çalıştığını gösteren belgeleri görmeyi bekliyoruz. Biyolojik ürünler için, tüm doğrulama verileri sunulur ve gözden geçirilir ve spesifikasyonlar, ürün lisanslama başvurusunun (PLA) bir parçası olarak belirlenir ve onaylanır.

      Üreticiler, çeşitli önemli işlem adımları için doğrulama raporlarına sahip olmalıdır. Örneğin, endotoksinleri uzaklaştırmak için bir iyon değişim sütunu kullanılıyorsa, bu işlemin sürekli olarak etkili olduğunu belgeleyen veriler olmalıdır. Bir üretici, işlemeden önce ve sonra endotoksin seviyelerini belirleyerek bu işlemin geçerliliğini gösterebilmelidir. Her bir temel saflaştırma adımının verimliliğini belirlemek için önce, sırasında ve sonrasında süreci izlemek önemlidir. Müstahzarın uzaklaştırıldığını göstermek için bilinen miktarda bir kirletici ile "spiking" prosedürü doğrulamak için yararlı bir yöntem olabilir.

      Tipik olarak, üreticiler küçük ölçekte saflaştırma süreçleri geliştirir ve belirli işlem adımının etkinliğini belirler. Ölçek büyütme yapıldığında, laboratuvar ölçekli operasyonla karşılaştırıldığında çeşitli farklılıklar için izin verilmelidir. Ürün daha uzun süre tampon ve sıcaklık koşullarına maruz kaldığından, daha uzun işlem süreleri ürün kalitesini olumsuz etkileyebilir. Saflaştırma koşulları altında ürün stabilitesi dikkatli bir şekilde tanımlanmalıdır. Üreticiler, belirli adımın sınırlamalarını ve etkinliğini tanımlamalıdır. Üretim boyutu partisi üzerindeki süreç doğrulaması, daha sonra ölçeği büyütmenin etkisini karşılaştıracaktır. Üreticiler, doğrulama için bazen küçük ölçekli geliştirme verilerini kullanabilir. Ancak, üretim boyutu partileri üzerinde doğrulama yapılması önemlidir.

      Bazı saflaştırma proseslerinin validasyonu için proses validasyonu ve/veya raporları gözden geçirilmelidir. Ek olarak, sürecin tutarlılığını sağlamak için kullanılan kontroller ve testler de gözden geçirilmelidir.

      Genellikle sütunlar, tekrarlanan kullanıma izin vermek için yeniden oluşturulur. Uygun validasyon prosedürleri uygulanmalı ve süreç kimyasal ve mikrobiyal kontaminasyon için periyodik olarak izlenmelidir.

      Üreticiler zaman zaman saflaştırma işleminden sonra ürünü reddederler. Düzenlemeye tabi diğer ürünlerde olduğu gibi, araştırma raporlarının eksiksiz olması ve diğer partilerle ilgili olması beklenmektedir. Örneğin, bir inceleme sırasında, düşük etki gücü ve yüksek kirlilik seviyeleri nedeniyle bir BDP'nin yaklaşık altı partisinin reddedildiği kaydedildi. Sorun bir sütuna atfedildi ve sütunda işlenen tüm partiler reddedildi. Herhangi bir parti başarısız spesifikasyonunun araştırılması gerektiği belirtilmelidir.

      Bu nedenle, belirli üretim ve kontrol sistemlerine daha ayrıntılı denetim kapsamı verilebilmesi için kusurlu ürünü belirlemek önemlidir.

      Suyun kalitesi, bitmiş ürünün kullanım amacına bağlı olmalıdır. Örneğin, CBER, proses suyu için Enjeksiyon için Su (WFI) kalitesini gerektirir. Öte yandan, in vitro teşhis için arıtılmış su yeterli olabilir. İlaçlar için gereken suyun kalitesi işleme bağlıdır. Ayrıca, işleme genellikle soğukta veya oda sıcaklığında gerçekleştiğinden, sıcak bir WFI sisteminin 75 ila 80 C'de kendi kendini temizleme özelliği kaybolur.

      Ekonomik nedenlerle, biyoteknoloji şirketlerinin çoğu, damıtma yerine ters ozmoz yoluyla WFI üretmektedir. Bu sistemlerin çoğunun kontamine olduğu tespit edilmiştir. Tipik olarak, sterilize edilmesi zor olan plastik boru (PVC) ve sızdırmaz olmayan depolama tankları kullanırlar. Soğuk bir sistemdeki herhangi bir iplik veya damla, mikroorganizmaların barınabileceği ve çoğalabileceği bir alan sağlar. Sistemlerden bazıları, bir terminal sterilizasyon filtresi kullanır. Bununla birlikte, birincil endişe endotoksinlerdir ve terminal filtre yalnızca kullanılan WFI'nin gerçek kalitesini maskelemeye hizmet edebilir. Bir sistemden endotoksinler için 0.1 ml'lik bir WFI örneğine güvenmenin sınırlamaları da kabul edilmelidir. Sistem, numunenin yalnızca yeterli şekilde çalıştığından emin olmak için hizmet ettiği yüksek saflıkta su verecek şekilde tasarlanmalıdır. Diğer WFI sistemlerinde olduğu gibi, soğuk WFI suyuna ihtiyaç duyulursa, kullanım noktası ısı eşanjörleri kullanılabilir.

      Tamponlar steril, pirojenik olmayan solüsyonlar olarak üretilebilir ve steril kaplarda saklanabilir. Daha küçük tesislerin bazıları ticari steril, pirojenik olmayan tampon çözeltileri satın almıştır.

      Reaktif sınıfı olabilen veya tampon olarak kullanılabilen steril olmayan suyun üretimi ve/veya depolanması hem stabilite hem de mikrobiyolojik açıdan değerlendirilmelidir.

      BDP için WFI sistemleri, diğer düzenlenmiş ürünler için WFI sistemleriyle aynıdır. Diğer ısıya duyarlı ürünlerde olduğu gibi, formülasyon için soğuk WFI kullanılır. Soğuk sistemler kirlenmeye eğilimlidir. Soğuk WFI hem endotoksinler hem de mikroorganizmalar için izlenmelidir. Doğrulama verileri ve izleme raporları gözden geçirilmelidir.

      Çeşitli işleme adımları sırasında ortamın mikrobiyolojik kalitesi bir endişe kaynağıdır. Süreç aşağı yönde devam ettikçe, çevresel kontrollere ve izlemeye daha fazla önem verilmelidir. BDP'nin izolasyonu için kullanılan ortam ve alanlar da mikrobiyolojik ve diğer yabancı kirleticileri en aza indirecek şekilde kontrol edilmelidir. BDP'nin tipik izolasyonu, sterilizasyon ve doldurmadan önce solüsyonun formülasyonu için kullanılan ortamla aynı kontrolde olmalıdır.

      TEMİZLİK PROSEDÜRÜ

      Kolonlar da dahil olmak üzere ekipmanın işlenmesi için temizleme prosedürlerinin validasyonu yapılmalıdır. Bu, özellikle çok ürünlü bir tesis için çok önemlidir. Üretici, söz konusu ekipman parçasında kullanılan her bir BDP veya ara madde için temizleme prosedürünün etkililik derecesini belirlemiş olmalıdır.

      Doğrulama verileri, temizleme işleminin belirli kalıntıları kabul edilebilir bir düzeye indireceğini doğrulamalıdır. Bununla birlikte, makul sayıda temizleme döngüsüyle bile, her türlü malzeme izini tamamen ortadan kaldırmak mümkün olmayabilir. Genellikle milyonda parça (ppm) olarak ifade edilen izin verilen kalıntı seviyesi, üretici tarafından gerekçelendirilmelidir. Temizleme, kolonun performansını olumsuz etkilemeden endotoksinleri, bakterileri, toksik elementleri ve kirletici proteinleri uzaklaştırmalıdır. Temizlik için özel muayene kapsamı şunları içermelidir:

        Detaylı Temizlik Prosedürü

      Ne yapılması gerektiği ve kullanılacak malzemelerin ayrıntılarını içeren yazılı bir ekipman temizleme prosedürü olmalıdır. Bazı üreticiler, her BDP ve ara ürün için spesifik çözücüyü listeler.

      Sabit gemiler için, genellikle yerinde temizlik (CIP) aparatlarıyla karşılaşılabilir. Bu sistemlerin değerlendirilmesi için, spesifik vanaların tanımlanması ile birlikte diyagramlar gerekli olacaktır.

      Temizlikten sonra, yüzeyin onaylanmış seviyeye kadar temizlendiğinden emin olmak için bazı rutin testler yapılmalıdır. Yaygın bir yöntem, son durulama suyunun veya çözücünün, o ekipmanda en son kullanılan temizlik maddelerinin mevcudiyeti için analizidir. Kalıntı maddenin her zaman doğrudan tespiti olmalıdır.

      "Temiz ne kadar temiz?" sorusunun cevabının bir kısmı, "analitik sisteminiz ne kadar iyi?" Modern analitik aparatın hassasiyeti, bazı algılama eşiklerini milyonda parça (ppm) altına, milyarda parçaya (ppb) indirmiştir.

      Her bir aparat parçası için belirlenen kalıntı limitleri pratik, ulaşılabilir ve doğrulanabilir olmalıdır. Bu limitleri gözden geçirirken, o seviyede kuruluş gerekçesini tespit edin. Üretici, izin verilen kalıntı seviyesinin bilimsel olarak sağlam bir temele sahip olduğunu veriler aracılığıyla belgeleyebilmelidir.

      Göz önünde bulundurulması gereken diğer bir faktör, kalıntının bir ekipman parçası üzerindeki olası homojen olmayan dağılımıdır. Gerçek ortalama kalıntı konsantrasyonu, tespit edilen seviyeden daha fazla olabilir.

      İŞLEME VE DOLUM

      Çoğu BDP, terminal olarak sterilize edilemez ve aseptik işleme ile üretilmelidir. Bir üründe veya cihazda prosesle ilgili kirleticilerin varlığı esas olarak bir güvenlik sorunudur. Kirleticilerin kaynakları öncelikle hücre substratı (DNA, konak hücre proteinleri ve diğer hücresel bileşenler, virüsler), ortam (proteinler, sera ve katkı maddeleri) ve saflaştırma işlemidir (süreçle ilgili kimyasallar ve ürünle ilgili safsızlıklar).

      Kararlılık hususları nedeniyle, çoğu BDP ya soğutulur ya da liyofilize edilir. Düşük sıcaklıklar ve düşük nem içeriği de mikrobiyolojik çoğalmaya karşı caydırıcıdır. Oda sıcaklığında bir çözelti olarak saklanan korunmamış tek doz biyofarmasötiğin (aseptik olarak doldurulmuş) aseptik işlenmesinin doğrulanması için, %0,1 ortam doldurma kontaminasyon oranı sınırlamaları kabul edilmelidir.

      Ortam doldurma verileri ve aseptik üretim sürecinin doğrulaması, bir inceleme sırasında gözden geçirilmelidir. Bazı BDP çok kararlı olmayabilir ve nazik karıştırma ve işleme gerektirebilir. Aseptik olarak doldurulmuş parenteraller için çift filtrasyon nispeten yaygın iken, BDP için genellikle düşük basınçlarda tek filtrasyon yapılır. Bu nedenle, verilen maksimum filtrasyon basınçları ile üretim talimatları spesifiktir.

      Denetim, tam ve spesifik olduklarından emin olmak için seri kayıtlarındaki üretim talimatlarının bir incelemesini içermelidir.

      Steril olmayan BDP'nin gruplanması için ortam ve erişilebilirlik kontrol edilmelidir. Bu ürünlerin birçoğunda koruyucu, doğal bakteriyostatik veya fungistatik aktivite bulunmadığından, sterilizasyon öncesi biyolojik yük düşük olmalıdır ve bu toplu çözeltilerin sterilizasyonundan önce ve doldurmadan önce biyolojik yük belirlenmelidir. Açıkçası, toplu çözeltilerin filtrelendiği (sterilize edildiği) zamana kadar mikrobiyolojik seviyelerde oluşabilecek herhangi bir potansiyel artışı önlemek için bu toplu çözeltilerin harmanlanması veya birleştirilmesi kontrol edilmelidir. Herhangi bir mikrobiyolojik seviye ile ilgili bir endişe, gelişebilecek endotoksinlerdeki olası artıştır. Bu ürünlerin birleştirilmesi için iyi uygulama, özellikle çözelti sterilizasyondan önce saklanacaksa, kontrollü bir ortamda ve kapalı tanklarda harmanlamayı da içerecektir. İyi uygulama, formülasyon ve sterilizasyon arasındaki üretim süresinin uzunluğuna ilişkin sınırlamaları da içerecektir.

      Proses içi testler, kalite kontrolünün önemli bir parçasıdır ve bir operasyonun gerçek, gerçek zamanlı performansının kabul edilebilir olmasını sağlar. Proses içi kontrol örnekleri şunlardır: akış parametreleri, kromatografi profilleri, protein türleri ve protein konsantrasyonları, biyoaktivite, biyolojik yük ve endotoksin seviyeleri. Bu süreç içi kontroller ve kabul kriterlerinin seçimi, doğrulama programından elde edilen sonuçlarla koordinasyon gerektirir.

      BDP'nin ampullere veya şişelere doldurulması, geleneksel ürünlerin işlenmesiyle aynı sorunların çoğunu sunar. Yerleşik şirketlerde bu konular nispeten rutindir. Bununla birlikte, yeni BDP tesisi için, steril operasyonların, ekipmanın ve sistemlerin validasyonu ile birlikte klinik etkinliği ve güvenliği geliştirmeye ve kanıtlamaya çalışmak, özellikle gereksinimler açıkça anlaşılmadığında uzun bir süreç olabilir.

      Bir BDP'nin parti boyutu, en azından ilk üretildiğinde muhtemelen küçük olacaktır. Küçük parti boyutu nedeniyle, dolum hatları, tipik olarak daha büyük miktarlarda doldurulan diğer ürünlerdeki kadar otomatik olmayabilir. Bu nedenle, özellikle bazı küçük, yeni şirketlerde bu ürünleri dolduran insanların daha fazla katılımı vardır.

      Doldurma sırasında tespit edilen problemler arasında yetersiz kıyafet eksikliği çevresel izleme programları şişelerin, özellikle liyofilize edilecek olanların elle durdurulması ve bazı temel sterilizasyon proseslerinin valide edilememesi sayılabilir. İnsanların dolum ve aseptik manipülasyonlara aktif katılımı nedeniyle, bu operasyonlara dahil olan kişi sayısı en aza indirilmeli ve bir çevre programı aseptik işleme alanlarında çalışan insanlardan alınan mikrobiyolojik örneklerin değerlendirilmesini içermelidir. Bu program, verilerle birlikte denetim sırasında gözden geçirilmelidir.

      Ürün stabilitesi ile ilgili diğer bir endişe, solüsyonun hem işlenmesi hem de doldurulması sırasında oksijenin yerini almak için inert gazın kullanılmasıdır. Oksidasyona duyarlı olabilecek diğer ürünlerde olduğu gibi, çözelti için çözünmüş oksijen seviyeleri için limitler oluşturulmalıdır. Benzer şekilde, doldurma işleminin validasyonu, oksijene duyarlı ürünler için havaya (oksijene) minimum düzeyde maruz kalmayı sağlamak için, kapatmaya göre hat hızı ve doldurma şırıngalarının konumu gibi parametreleri içermelidir. İnert gaz yer değiştirmesinin olmadığı durumlarda, üretici ürünün oksijenden etkilenmediğini gösterebilmelidir. Bu veriler bir inceleme sırasında gözden geçirilebilir (Bu veriler, Ürün Lisanslama Başvurusu (PLA) incelemesinin bir parçası olarak değerlendirilir).

      Tipik olarak, liyofilize edilecek şişeler, makine tarafından kısmen kapatılır. Bununla birlikte, her bir tıpayı şişenin üzerine elle yerleştirmek için bir operatör kullanan bazı doldurma hatları gözlemlenmiştir. Endişe, operatör tarafından sunulan kontaminasyonun acil yoludur. Operatörlerin gözlemi ve dolum işlemlerinin aktif olarak gözden geçirilmesi yapılmalıdır.

      Liyofilize bir ürünün doldurma işlemiyle ilgili bir diğer önemli endişe, doldurma hacimlerinin güvencesidir. Açıktır ki, düşük bir dolum, flakonda bir alt potansiyeli temsil edecektir. Bir toz veya sıvı dolgunun aksine, özellikle aktif bileşenin sadece bir miligram olabileceği bir ürün için, liyofilizasyondan sonra düşük bir dolum kolayca görülmez. Klinik önemi nedeniyle, bir şişedeki alt potansiyel potansiyel olarak klinik olarak çok ciddi bir durum olabilir.

      Yine muayene, sadece aseptik uygulamalarla ilgili değil, aynı zamanda dolum üniformitesi için de dolum operasyonlarının gözlemini ve gözden geçirilmesini içermelidir.

      Birçok ürün stabilite endişeleri için liyofilize edilir. Ne yazık ki, liyofilizatörlerin tasarımının GMP yönleri, diğer işleme ekipmanları için kullanılan sterilizasyon ve kontrol teknolojisinin gerisinde kalmıştır. Liyofilizasyon işlemiyle ilgili birçok problemin tespit edilmiş olması şaşırtıcı değildir.

      Bu problemler BDP ile sınırlı olmayıp genel olarak BDP dahil tüm ürünlerin liyofilizasyonu ile ilgilidir. Liyofilizasyon ve kontrollere ilişkin ayrıntılı bir tartışma, 18.04.86 tarihinde yayınlanan 43 numaralı Muayene Teknik Kılavuzunda bulunabilir.

      LABORATUVAR KONTROLLERİ

      Firmanın laboratuvar tesisinin denetimi sırasında, aşağıdaki alanlar gözden geçirilmeli ve eksiklikler varsa belgelenmelidir:

      Laboratuvar personeli, yaptıkları işler için yeterli eğitime sahip olmalıdır.

      Firmalar, hammaddelerin, ürünlerin, numunelerin ve referans reaktiflerin ölçümü, test edilmesi ve depolanması ile ilgili laboratuvar ekipmanlarının bakımı, kalibrasyonu ve izlenmesi için dokümantasyona ve programlara sahip olmalıdır.

      Tüm laboratuvar yöntemleri, test yöntemlerinde belirtilen ekipman ve reaktiflerle doğrulanmalıdır. Satıcıdaki ve/veya ana ekipman/reaktiflerin teknik özelliklerindeki değişiklikler, yeniden doğrulama gerektirecektir.

      Firmalar, sunulan başvurularda doğrulama parametrelerini desteklemek için ham verilere sahip olmalıdır.

      Referans standartlar iyi tanımlanmalı ve belgelenmeli, uygun şekilde saklanmalı, güvenceye alınmalı ve test sırasında kullanılmalıdır.

      Enzimler, antikorlar, test reaktifleri vb. gibi laboratuvar kültürleri ve reaktifleri, uygun saklama koşulları altında tutulmazsa bozulabilir.

      Prosedürler yazılı, uygulanabilir ve takip edilmelidir. Kalite kontrol numuneleri uygun şekilde ayrılmalı ve saklanmalıdır.

      Aşağıdaki testler, bileşen, süreç içi, yığın ve/veya nihai ürün testlerine uygulanabilir. Gerekli testler, sürece ve ürünün kullanım amacına bağlı olacaktır.

      Pirojen Kontaminasyonu - Pirojenisite testi, tavşanlara nihai ürün enjekte edilerek veya limulus amebosit lizat (LAL) testi ile yapılmalıdır. Doğal ürünün kabulü için kullanılan kriterlerin aynısı biyoteknolojik ürün için de kullanılmalıdır.

      Bazı in vitro diagnostik ürünlerde endotoksinlerin bulunması cihazın performansını etkileyebilir. Ayrıca in vivo ürünlerin pirojenler için test edilmesi de önemlidir. Bazı biyolojik farmasötikler, LAL testini ve tavşan pirojen testini geçmesine rağmen insanlarda pirojeniktir. Bu fenomen, yalnızca insanlarda pirojenik gibi görünen malzemelerden kaynaklanıyor olabilir. İnsan deneklerin bir pirojenik tepki yaşayıp yaşamayacaklarını tahmin etmeye çalışmak için bir endojen pirojen tahlili kullanılır. İnsan kanı mononükleer hücreleri, nihai ürünle in vitro olarak kültürlenir ve hücre kültürü sıvısı, tavşanlara enjekte edilir. Tavşanlardaki ateş, ürünün insanlarda pirojenik olabilen bir madde içerdiğini gösterir.

      Karşılaşılabilecek testler:

      Viral Kontaminasyon - Viral kontaminasyon testleri, kullanılan hücre substratı ve kültür koşullarına uygun olmalıdır. Nihai ürünü kontamine eden saptanabilir tesadüfi virüslerin olmadığı gösterilmelidir.

      Karşılaşılabilecek testler:

      Nükleik Asit Kontaminasyonu - Nükleik asit safsızlıkları ile ilgili endişe, bir alıcıda hücresel transformasyon olaylarının olasılığından kaynaklanır. Saflaştırma işleminin her aşamasında nükleik asidin çıkarılması, eklenen konakçı hücre DNA'sının eliminasyon kapsamının incelenmesiyle pilot deneylerde gösterilebilir. Böyle bir analiz, saflaştırma sırasında nükleik asidin çıkarılmasının teorik kapsamını sağlayacaktır.

      Nihai ürünün birkaç üretim lotunda nükleik asidin doğrudan analizleri, nick-translasyonlu konak hücre ve vektör DNA gibi uygun problar kullanılarak hareketsizleştirilmiş kirletici nükleik asidin hibridizasyon analizi ile gerçekleştirilmelidir. Hücre substratından türetilen DNA'nın dönüştürülmesine ilişkin teorik kaygılar, kirletici nükleik asidin genel olarak indirgenmesiyle en aza indirilecektir.

      Ürünle ilgili proteinler için karşılaşılabilecek testler:

      Yabancı proteinler için karşılaşılabilecek testler:

      Mikrobiyal Kirlenme - Tespit edilebilir bakterilerin (aeroblar ve anaeroblar), mantarların, mayaların ve uygulanabilir olduğunda mikoplazmanın bulunmadığını gösteren mikrobiyal kontaminasyon için uygun testler yapılmalıdır.

      Karşılaşılabilecek testler:

      Kimyasal Kirleticiler - Diğer kontaminasyon kaynakları, örneğin alerjenler, petrol yağları, artık çözücüler, temizlik malzemeleri, kolondan sızabilen malzemeler vb. dikkate alınmalıdır.

      1. Kalite
        1. Renk/Görünüm/Netlik
        2. Partikül Analizi
        3. pH Tayini
        4. Nemli içerik
        5. Konak Hücre DNA'sı

        Kimlik için tek bir test yeterli olmayabilir. Kullanılan yöntemlerin valide edildiğinin teyidi gereklidir. Referans materyalin mevcudiyeti kontrol edilmelidir. Ürünün uygun bir biyo-tahlilde referans preparasyonla karşılaştırılması, ürünün kimliği ve gücü ile ilgili ek kanıtlar sağlayacaktır.

        Karşılaşılabilecek testler:

        1. Peptid Haritalama (indirgenmiş/indirgenmemiş)
        2. Jel elektroforezi
          • GBF SAYFASI
          • İzoelektrik Odaklama (IEF)
          • immünoelektroforez
        3. 2 Boyutlu Elektroforez
        4. Kapiler Elektroforez
        5. HPLC (Kromografik Tutma)
          • bağışıklık tahlili
          • ELISA
          • Batı lekesi
          • radyoimmunoassay
        6. Amino Asit Analizi
        7. Amino Asit Sıralaması
        8. Kütle Spektroskopisi
        9. Molekül Ağırlığı (SDS SAYFASI)
        10. Karbonhidrat Bileşim Analizi (glikosilasyon)

        Karşılaşılabilecek testler:

        • Protein Miktarları
        • Lowry
        • Biüret Yöntemi
        • UV Spektrofotometrisi
        • HPLC
        • Amino Asit Analizi
        • *Kısmi Dizi Analizi

        "Saflık", alıcı için zararlı veya ürün için zararlı olsun ya da olmasın, bitmiş üründe yabancı maddelerden göreceli olarak serbestlik anlamına gelir. Saflık, kalıntı nemden veya diğer uçucu maddelerden ve pirojenik maddelerden bağıl özgürlüğü içerir, ancak bununla sınırlı değildir. Protein safsızlıkları en yaygın kirleticilerdir. Bunlar fermantasyon sürecinden, ortamdan veya konakçı organizmadan kaynaklanabilir. Monoklonal antikor üretimi için kullanılan hibridomlarda endojen retrovirüsler mevcut olabilir. Bu bileşenler için özel testler, in vivo ürünlerde zorunludur.Ürünün güvenliğini ve etkinliğini sağlamak için yabancı antijenik proteinlerin uzaklaştırılması esastır.

        Karşılaşılabilecek testler:

        1. Protein Safsızlıkları için Testler:
          1. elektroforez
            • GBF SAYFASI
            • IEF
            • 2 Boyutlu Elektroforez
          2. Peptit Haritalama
          3. Çoklu antijen ELISA
          4. HPLC Boyut Dışlama HPLC Ters Fazlı HPLC
          1. DNA Hibridizasyonu
          2. HPLC
          3. Pirojen/Endotoksin Testi
            • U.S.P. Tavşan Pirojen Testi
            • Limulus Amebosit Lizatı (LAL) E
            • doğal Pirojen Testi
          • U.S.P. Tavşan Pirojen Testi
          • Limulus Amebosit Lizatı (LAL)
          • Test Endojen Pirojen Testi
          • Birkaç hücre tipinde sitopatik etki
          • Hemabsorbsiyonlu Embriyonlu Yumurta Testi
          • Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)
          • Viral Antijen ve Antikor İmmünoassay
          • Fare Antikor Üretimi (MAP)
          • DNA Hibridizasyonu (Dot Blot)
          • Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)
          • GBF SAYFASI
          • PLC
          • IEF
          • immünolojik testler
          • Radyoimmunoassayler
          • ELISA
          • Batı lekesi
          • GBF Sayfası
          • 2 Boyutlu Elektroforez
          • U.S.P. Sterilite Testi
          • Heterotrofik Plaka Sayısı ve Toplam Mayalar ve Küfler
          • Toplam Plaka Sayısı
          • Mikoplazma Testi
          • LAL/Pirojen

          "Potans", uygun laboratuvar testleri veya ürünün amaçlanan şekilde uygulanması yoluyla elde edilen uygun şekilde kontrol edilen klinik verilerle belirli bir sonuç üretmeye yönelik spesifik yeteneği veya kapasitesi anlamına gelir. Potansiyel testleri, her bir ürün için, potensini gösterecek şekilde özel olarak tasarlanmış in vitro veya in vivo testlerden veya her ikisinden oluşmalıdır. Biyolojik aktivite için bir referans preparasyon oluşturulmalı ve nihai ürünün biyoaktivitesini belirlemek için kullanılmalıdır. Not: Uygulanabilir olduğunda, kurum içi biyolojik güç standartları uluslararası (Dünya Sağlık Örgütü (WHO), Ulusal Biyolojik Standartlar ve Kontrol Enstitüsü (NIBSC)) veya ulusal (Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH), Ulusal Kanser) ile çapraz referanslandırılmalıdır. Enstitü (NCI), Gıda ve İlaç Dairesi (FDA)) referans standart müstahzarları veya USP standartları.

          Karşılaşılabilecek testler:

          1. Doğrulanmış potens belirleme yöntemi
            • Bütün Hayvan Biyo-tahlilleri
            • Hücre Kültürü Biyoanalizleri
            • Biyokimyasal/Biyofizik Testler
            • Reseptör Bazlı İmmünoanalizler
          2. Potansiyel Sınırları
          3. Potensi olumsuz etkileyebilecek ajanların belirlenmesi
          4. Fonksiyonel aktivitenin ve antijen/antikor özgüllüğünün değerlendirilmesi
            • Çeşitli immunodifüzyon yöntemleri (tek/çift)
            • İmmünoblotlama/Radyo veya Enzim bağlantılı İmmünoanalizler
          5. Belirli pikleri biyolojik aktiviteyle ilişkilendirmek için HPLC tarafından doğrulanmıştır

          "Kararlılık", bir ürünün, zamanın bir fonksiyonu olarak kimliğini, gücünü, kalitesini, saflığını, güvenliğini ve etkinliğini sağlamak için oluşturulan spesifikasyonlar dahilinde kalma kapasitesidir. Nihai ürün üzerinde önerilen tarihleme dönemini destekleyecek çalışmalar yapılmalıdır. Gerçek zamanlı kararlılık verileri, önerilen tarihleme dönemini desteklemek için gerekli olacaktır. Test, potens stabilitesi, pH, berraklık, renk, partiküller, fizikokimyasal stabilite, nem ve koruyucuları içerebilir. Hızlandırılmış stabilite testi verileri destekleyici veriler olarak kullanılabilir. Hızlandırılmış testler veya stres testleri, abartılı depolama koşulları kullanılarak bir maddenin veya ürünün kimyasal veya fiziksel bozunma oranını artırmak için tasarlanmış çalışmalardır. Amaç, geçici son kullanma tarihleme dönemini tahmin etmek için kinetik parametreleri belirlemektir. Ürünün stres testi, depolama ve nakliye sırasında karşılaşılabilecek olası sorunları belirlemek ve son kullanma tarihini tahmin etmek için sıklıkla kullanılmaktadır. Bu, nakliye ve depolama koşullarına uygun olarak sıcaklık dalgalanmalarının etkilerine ilişkin bir çalışmayı içermelidir. Bu testler, pazarlanan ürüne yönelik kaplar ve kapaklar ile gerçekçi saha koşulları altında geçerli bir tarihlendirme periyodu oluşturmalıdır.

          Nispeten kırılgan biyoteknik olarak türetilen bazı proteinler, nazik karıştırma ve işleme ve düşük basınçta yalnızca tek bir filtreleme gerektirebilir. Üretim talimatları, nihai üründe stabiliteyi korumak için verilen maksimum filtrasyon basınçlarına özel olmalıdır. Mikrobiyal kontaminasyonu kontrol etmek için koruyucular içeren ürünler, izlenen koruyucu içeriğine sahip olmalıdır. Bu, mikrobiyal yükleme testleri (yani U.S.P. Antimikrobiyal Koruyucu Etkililik Testi) veya koruyucu için kimyasal testler yapılarak gerçekleştirilebilir. Ele alınması gereken alanlar şunlardır:

          • Stabilite testi ortamının etkin şekilde izlenmesi (yani ışık, sıcaklık, nem, kalan nem)
          • Toplu depolama için kullanılan kap/kapak sistemi (yani ekstrakte edilebilirler, proteinin kimyasal modifikasyonu, ekstrakte edilebilir profili değiştirebilecek stoper formülasyonlarında değişiklik)
          • Ürün kararsızlığına neden olabilecek malzemeleri tanımlayın ve agregasyon, denatürasyon, parçalanma, deaminasyon, fotoliz ve oksidasyonun varlığını test edin
          • Agregaları veya bozunma ürünlerini belirlemek için testler.

          Karşılaşılabilecek testler:

          1. GBF SAYFASI
          2. IEF
          3. HPLC
          4. İyon Değişim Kromatografisi
          5. Jel Filtrasyon
          6. Peptit Haritalama
          7. Spektrofotometrik Yöntemler
          8. Potens Testleri
          9. Performans testi
          10. 2 Boyutlu Elektroforez

          Bir üreticinin standartlaştırılmış ve güvenilir bir ürün ürettiğini belirlemenin temel kriteri, önceden belirlenmiş belirli sürüm özelliklerine göre partiden partiye tutarlılığın gösterilmesidir.

          • Tekdüzelik: kimlik, saflık, fonksiyonel aktivite
          • Kararlılık: Raf ömrü boyunca kabul edilebilir performans, kesinlik, duyarlılık, özgüllük

          ÇEVRE KAPSAMI

          Biyoteknoloji tesisleri için çevre/biyo-çevreleme kapsamı, özellikle ön onay veya lisans öncesi denetimler olmak üzere, düzenli GMP denetimlerinin bir parçası olarak gerçekleştirilmelidir. FDA, FDA tarafından düzenlenen ürünlerin üretimi, kullanımı ve imha edilmesi nedeniyle oluşabilecek çevresel etkilerin belirlenmesinden Ulusal Çevre Politikası Yasası (NEPA) kapsamında sorumludur. Onaylanmamış bir ürün uygulamasının varlığından FDA tarafından başka hiçbir federal veya eyalet düzenleyici kurumu bilgilendirilemez. Sonuç olarak, FDA ayrıca ürün sponsorunun araştırmaları güvenli bir şekilde yürüttüğünden emin olmalıdır.

            Çevresel Değerlendirmeler

          Tipik olarak, bir ürün sponsoru, ürün uygulamasının bir parçası olan çevresel değerlendirmelerde (EA'lar) çevresel kontrol önlemlerini açıklar. Ürün onaylandığında, EA halka yayınlanır. FDA, EA'da yer alan bilgilerin doğruluğunu ve uygunluğunu doğrulayabilmelidir. Araştırmacı, firmanın GMP denetimine konu olan ürünün imalatını ele alan çevresel değerlendirmesinin bir kopyasına sahip olmalıdır. EA, sağlanmadıysa menşe ofisten talep edilmelidir.

          1. Rekombinant DNA Araştırmaları için NIH Yönergelerini gözden geçirin (1987, 1988, 1991). İyi Endüstriyel Büyük Ölçekli Uygulamalara uygun sınırlama düzeyi için kılavuzların oluşturulmasına ilişkin olarak Ek K'ye (1991) özellikle dikkat edin (bkz. referanslar).
          2. Biyolojik çevreleme ve atık işleme sistemlerinin bir parçası olarak EA'da açıklanan ekipman ve kontrollerin, ekipmanın bulunduğu, çalıştığı ve uygun şekilde bakımının yapıldığı standartlarda çalışacak şekilde doğrulandığını belirleyin. Bu tür ekipman, örneğin, HEPA filtrelerini, ısı veya hipoklorit işleme tabi tutulmuş dökülme toplama tanklarını ve biyoreaktörler ve ilgili drenajların etrafına set çekmeyi içerebilir. SÇP'ler, dökülmelerin temizlenmesi, personelin kazara maruz kalması durumunda alınacak önlemler, kapların açılıp kapanması, numune alma ve numune alma işlemleri için ve muhafazanın ihlal edilmesini veya maruz kalınan durumlarda diğer prosedürler için kullanılıyor olmalıdır. canlı hücreler oluşabilir.
          3. Organizmaların uygun biyo-çevreleme uygulamalarına tabi olduğunu doğrulamak için tasarlanmış bir işyeri ve/veya çevresel izleme programı olup olmadığını belirleyin. Sonuçların örneklenmesi, izolasyonu, sayımı ve raporlanması için SÇP'leri gözden geçirin. Merkeze gönderilen raporlara dahil edilmek üzere ilgili SÇP'lerin ve izleme verilerinin kopyalarını edinin.
          4. Denetlenen tesis için emisyonları ve iş güvenliğini yöneten tüm federal, eyalet ve yerel izinlerin kopyalarını isteyin ve alın. İzinlerden herhangi birinin süresinin dolup dolmadığını ve izinlerin ihlaliyle ilgili bekleyen herhangi bir dava olup olmadığını belirleyin.
          5. Yabancı ülkelerdeki tesisler için de aynı prosedürler izlenmelidir. Yabancı ülke şartlarına uygunluk gösterilmelidir.

          EK:

          TEST YÖNTEMLERİ

          Afinite Kromatografisi - Hedef türe özgü kimyasal etkileşime dayalı bir kromatografi ayırma yöntemi. Afinite yöntemlerinin türleri şunlardır: biyosorpsiyon - bölge tanıma (örneğin, monoklonal antikor, protein A) hidrofobik etkileşim - sulu çözeltilerde polar olmayan bölgeler arasındaki temaslar boya-ligand makromoleküllerin triazin ve trifenilmetana spesifik bağlanması boyalar metal şelat - matris bağlı şelat kompleksleri hedef molekül ile düşük meleküler ağırlıklı metal bağlı ligandları değiştirerek ve hafif koşullar altında tersine çevrilebilir kovalent - disülfid bağıyla.

          Amino Asit Bileşimi Analizi - Amino asit bileşimini ve/veya protein miktarını belirlemek için kullanılır. Proteinin bileşen amino asitlerine tam hidrolizini (kimyasal veya enzimatik) ve ardından kromatografik ayırma ve HPLC yoluyla nicelemeyi içeren iki aşamalı bir işlem. Peptit veya proteinin tam amino asit bileşimi, metionin, sistein ve triptofan için doğru değerleri içermelidir. Sunulan amino asit bileşimi, her lot numarasının en az üç (3) ayrı hidrolizatının ortalaması olmalıdır. Triptofan ve/veya metionin gibi genellikle düşük miktarlarda bulunan bu amino asit kalıntıları için integral değerler elde edilebilir ve saflık argümanlarını desteklemek için kullanılabilir.

          Amino Asit Dizilimi - Bir protein veya polipeptit içindeki amino asitlerin amino terminal veya karboksi terminal dizilimi yoluyla kısmi dizilimi (8-15 kalıntı). Bu yöntem, proteinin birincil yapısı, homojenliği ve polipeptit bölünmelerinin varlığı veya yokluğu hakkında bilgi elde etmek için yapılır. HPLC analizi ile belirlenen dizi verileri tablo şeklinde sunulur ve her bir ardışık bölünme döngüsünde her amino asit için toplam verimi içermelidir. Tam sekans, genellikle HPLC fraksiyonasyonundan izole edilen peptit fragmanlarının sekanslanmasıyla yapılır.

          Kapiler Elektroforez - Özellikle peptit haritalama için HPLC'ye tamamlayıcı olarak kullanılır. Bu teknik daha hızlıdır ve genellikle HPLC kullanarak coelute olan peptitleri ayırır. Ayırma, bir elektrik akımına yanıt olarak bir tampondaki peptitlerin nispi hareketliliği ile gerçekleştirilir.

          Karbonhidrat Analizi - Glikoproteinlerdeki kovalent olarak bağlı monosakaritlerin bileşiminin tutarlılığını belirlemek için kullanılır. Üretimin genetik kod tarafından kontrol edildiği glikoproteinin polipeptit zincirinin aksine, oligosakkaritler translasyon sonrası enzimler tarafından sentezlenir. Karbonhidrat zincirlerinin mikroheterojenliği yaygındır. Tespit, türevlendirmeden sonra darbeli amperometrik algılama ile HPLC ayırma ile hidrolizden sonra türevlendirilmemiş şekerler üzerinde veya gaz kromatografisi ile gerçekleştirilebilir.

          Dairesel Dikroizm - Optik döner dispersiyon ile, bir protein içindeki ikincil yapıyı belirlemek ve spesifik yapı formlarını (a-sarmal, B-katlamalı tabaka ve rastgele bobin) ölçmek için kullanılan optik spektrofotometrik yöntemlerden biri. Elde edilen spektrumlar, doğal protein formununkiyle veya rekombinant için referans standardıyla karşılaştırılır.

          DNA Hibridizasyon (Dot Blot) Analizi - Hücresel DNA'nın spesifik DNA probları ile hibridizasyonu kullanılarak DNA'nın nanogram seviyesinde tespiti. Tezahür, 32P-etiketleme, kemilüminesans, kromojenik veya avidin-biyotin tahlilleri ile olabilir.

          Edman Degradasyonu - Amino terminalinden bir tür protein dizilimi.

          Elektroforez - Moleküllerin veya moleküler komplekslerin, bir elektrik alanına yerleştirildiğinde göreceli göç etme yetenekleri temelinde ayrıldığı yöntemler. Bir analit, bir elektroforetik destek üzerine yerleştirilir, ardından yük (izoelektrik odaklama) veya moleküler ağırlık (SDS-PAGE) ile ayrılır. Görselleştirme, proteinin seçici olmayan (Coomassie Blue) veya seçici (gümüş) boyama teknikleriyle boyanmasıyla gerçekleştirilir.

          Coomassie mavisini kullanan boya bağlama yöntemi, jelleri okumak için bir lazer dansitometre kullanıldığında ölçülebilir bir tekniktir. Gümüş boyama yöntemi çok daha hassastır ve bu nedenle düşük seviyelerde protein safsızlıklarının saptanması için kullanılır, ancak proteinden proteine ​​boyamanın değişkenliği nedeniyle miktar tayini için kullanılamaz.

          İki Boyutlu Jel Elektroforezi - Proteinlerin önce bir yönde yük ile ayrıldığı, ardından dikey yönde bir boyut ayrımının yapıldığı bir elektroforez türü.

          Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) - Bilinmeyen kalıntı (konak) hücresel protein ve istenen proteinin teyidi için bir multiantijen testi. Bir ürünün potensini belirlemek için kullanılabilir. Son derece spesifik ve hassas, temelde basit ve ucuzdur. Test için kullanılan poliklonal antikorların hazırlanması için bir immünojen olarak hizmet etmek üzere konakçı hücre protein safsızlıklarının bir referans standart preparasyonunu gerektirir.

          Endojen Pirojen Testi - Endotoksin tarafından üretilen endojen pirojenin insan monositlerinden salınmasına dayanan bir in vitro test. Bu tahlil, USP Tavşan Pirojen Testinden daha duyarlı görünmektedir, ancak LAL tahlilinden çok daha az hassastır. İnsan monositlerinden pirojenik tepkiye neden olan tüm maddeleri tespit edebilme avantajına sahiptir.

          Jel Geçirgenliği veya Filtrasyon (Boyut Dışlama) Kromatografisi (GPC, GFC veya SEC) - Ayrılan bileşenlerin moleküler boyutuna veya hidrodinamik hacmine dayalı bir ayırma yöntemi. Bu, proteinlerin doğal hallerinde veya deterjanlarla denatüre edilmesiyle gerçekleştirilebilir.

          Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) - Ürünü (veya bileşen peptitlerini veya amino asitlerini) sıvı halde katı bir destek matrisi içeren bir kromatografik kolondan geçirerek bir BDP'nin saflığını karakterize etmek veya belirlemek için kullanılan bir enstrümantal ayırma tekniği. Ayırma modu, yani ters faz, iyon değişimi, jel filtrasyonu veya hidrofobik etkileşim, kolon matrisi ve mobil faz tarafından belirlenir. Algılama genellikle UV absorbansı veya elektrokimyasal yollarla yapılır.

          Hidrofobik Etkileşim Kromatografisi (HIC) - HIC, bir proteinin hidrofobik kısımlarının fenil veya kısa zincirli hidrokarbonlar gibi varlıkları içeren hafif hidrofobik bir yüzeye bağlanmasıyla yüksek tuzlu ortamda gerçekleştirilir. Protein, kolondan en son yıkanan hidrofobik proteinlerle birlikte azalan bir tuz gradyanında ayrıştırılabilir.

          İmmünoassay - Yüksek afiniteli antikorun proteinleri tanımlamak ve ölçmek için kullanılan antijen ile etkileşiminin ölçümüne dayanan kalitatif veya kantitatif bir tahlil tekniği.

          İmmünoblotlama - Bir jelden antikor/antijeni, üzerinde tamamlayıcı antijen/antikoru ile kompleks oluşturabilecekleri bir nitroselüloz filtreye aktarmak için bir teknik.

          İmmünodiffüzyon (tekli) - Ürünün (antijen), tamamlayıcı antikorunu içeren agar gibi bir ortam içine iyi kesilmiş bir ortama yerleştirildiği bir kimlik difüzyon tekniği. Ürün, yoğunluğu antijen konsantrasyonunun bir fonksiyonu olan halka şeklinde bir çökelti oluşturarak ortama yayılır.

          İmmünodiffüzyon (çift, Ouchterlony tekniği) - Bir antijen ve antikorun, agar gibi bir besiyerinde kesilmiş iki bitişik kuyuya yerleştirildiği bir teknik. Ortamdan yayıldıkça, ilgili konsantrasyonların kafes oluşumu için optimum oranda olduğu noktada antijen/antikor komplekslerinin görünür çökelme çizgilerini oluştururlar.

          İyon Değişim Kromatografisi (IEC) - Proteinin yüküne ve kolonun kimyasal omurgası için göreli afinitesine dayalı bir gradyan tahrikli ayırma. Anyon/katyon değişimi, proteinler için yaygın olarak kullanılır.

          İzoelektrik Odaklama (IEF) - Proteinleri pI'lerine göre ayıran bir elektroforetik yöntem. Net yük taşımadıkları izoelektrik noktasında bulunana kadar bir elektrik alanındaki pH gradyan ortamında hareket ederler. pI'lerine ulaşmadan önce, protein hareketliliği aynı zamanda boyuta, konformasyona, pH gradyanının dikliğine ve voltaj gradyanına da bağlıdır. Bu yöntem, bir proteinin yanlış veya değiştirilmiş formlarının yanı sıra protein safsızlıklarını tespit etmek için kullanılır.

          Limulus Amiposit Lizat Testi (LAL) - Endotoksinin bir at nalı yengecinin kanında pıhtılaşma reaksiyonuna neden olma yeteneğini kullanarak endotoksinlerin varlığına yönelik hassas bir test. LAL testi, tavşan testinden daha kolay, daha hızlı, daha az maliyetli ve çok daha hassastır, ancak yalnızca endotoksinleri saptayabilir ve tüm pirojen türlerini tespit edemez ve bu nedenle USP Tavşan Pirojen testinin yerine kullanılmadan önce tamamen doğrulanmalıdır. LAL testinin çeşitli biçimleri arasında bir jel pıhtı testi, bir kolorimetrik test, bir kromojenik test ve bir türbidimetrik test bulunur.

          Kütle Spektrometresi - Peptidlerin ve küçük proteinlerin moleküler kütlesini belirleyerek birincil yapı analizinde faydalı bir teknik. Peptit bileşimindeki varyantları tanımlamak için genellikle peptit haritalama ile birlikte kullanılır. Disülfid bağlarını bulmak ve translasyon sonrası değişiklikleri belirlemek için kullanışlıdır.

          Northern Blot - RNA fragmanlarını bir agaroz jelden, üzerinde tamamlayıcı bir DNA'ya hibridize edilebilecekleri bir nitroselüloz filtresine aktarma tekniği.

          Peptid Haritalama - Yüksek düzeyde spesifik enzimler kullanarak proteinlerin peptitlere parçalanmasını içeren güçlü bir teknik. Enzimler, proteinleri öngörülebilir ve yeniden üretilebilir amino asit bölgelerinde parçalar ve elde edilen peptitler, HPLC veya elektroforez yoluyla ayrılır. Bir numune peptit haritası, bir ürünün kimlik profilinin oluşturulmasında doğrulayıcı bir adım olarak bir referans numune üzerinde yapılan bir harita ile karşılaştırılır. Ayrıca disülfid bağlarının doğrulanması, karbonhidrat bağlanmasının yeri, dizi analizi ve safsızlıkların ve protein bozulmasının tanımlanması için kullanılır.

          Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) - Nükleik asidi amplifiye etmek için in vitro teknik. Teknik, bir dizi tekrarlanan yüksek sıcaklıkta denatürasyon, düşük sıcaklıkta oligonükleotit primer tavlama ve orta sıcaklıkta zincir uzatma döngülerini içerir. Nükleik asit, 25-30 döngüden sonra milyon kat amplifiye edilebilir.

          Protein Kantifikasyonu - Toplam protein miktarının tayini bir dizi tahlille yapılabilir. Geri kalanından daha iyi olan hiçbir yöntem yoktur, her birinin testi yapmak için gereken protein miktarından proteinler arasındaki değişkenlik sorununa kadar kendi dezavantajları vardır. Tiplerden bazıları Lowry, Bicinchonic Asit (BCA), Bradford, Biuret, Kjeldahl, Ultraviyole spektroskopisini içerir.

          Protein Dizilimi - (Bkz. Amino Asit Dizilimi).

          Tavşan Pirojen Testi. USP - Pirojenlerin varlığı için bir test (LAL testinde olduğu gibi endotoksinlerle sınırlı değildir), test materyalinin iyi kontrol edilmiş ve geçmişi bilinen tavşanlara enjeksiyonunu içerir.Tavşanlar daha sonra üç saatlik bir süre boyunca sıcaklıkta bir artış için izlenir.

          Radyoimmünoassay (RIA) - Antijen veya antikor üzerinde radyoaktif bir etikete (etiket) sahip olan immünolojik testler için genel bir terim. Yaygın etiketler, tahlil saptama ve niceleme için kullanılan I125 ve H3'ü içerir. Klasik RIA'lar, antijen ve etiketli antijenin, antikor üzerinde sınırlı sayıda sabit sayıda bağlanma yeri için rekabet ettiği rekabetçi bağlanma tahlilleridir. Antikora bağlı etiketli kompleks, antijenin konsantrasyonu ile ters orantılıdır.

          Ters Faz Kromatografisi - Polar olmayan hidrofobik yüzey vermek üzere kaplanmış bir kolon sabit fazına dayanan kromatografik bir ayırma yöntemi. Analit retansiyonu, çözünen ve yüzey arasındaki hidrofobik reaksiyonlarla orantılıdır. Tutma, bağlı karbon zincirinin uzunluğu ile kabaca orantılıdır.

          SDS PAGE (Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi) - Proteinlerin moleküler ağırlıklarına göre elektroforetik olarak ayrılması. SDS'nin eklenmesiyle moleküllere düzgün bir net negatif yük uygulanır. Bu koşullar altında, bir jel matrisi yoluyla anoda doğru göç, daha küçük moleküllerin en uzun mesafeye göç etmesiyle, yük değil, boyut yoluyla ayrılmaya izin verir. Bu teknik, yaklaşık MW'nin altındaki boyutlar için güvenilir değildir. 8000.

          Proteinler, Coomassie mavisi veya gümüş boyama yoluyla gözlemlenir veya antijen/antikor özgüllük testi için ayrıca membranlara aktarılabilir.

          Southern Blot - DNA parçalarını bir agaroz jelden, üzerinde tamamlayıcı bir DNA'ya hibridize edilebilecekleri bir nitroselüloz filtreye aktarma tekniği.

          UV Spektroskopisi - Yan zincir kromoforlarının (fenilalanin, triptofan ve tirozin) varlığı nedeniyle ayırt edici absorpsiyon spektrumlarını kullanan proteinler için bir niceleme tekniği. Bu absorbans lineer olduğundan, yüksek oranda saflaştırılmış proteinler, molar yok olma katsayıları kullanılarak hesaplamalarla nicelendirilebilir.

          Western Blot - Bu test, kontamine hücre substratlarını tespit etmek ve rekombinant polipeptitleri değerlendirmek için kullanılır. Elektroforetik ayırmadan sonra, negatif yüklü proteinler (antijenler), poliakrilamid jelden jelin anot tarafında konumlandırılmış bir nitroselüloz membran üzerine elektroforetik olarak transfer edilir. Membranın spesifik bir antikor ile inkübasyonunu takiben, tespit için başka bir anti-antikor ile etiketlenirler.

          GELİŞTİRİCİ ORGANİZMA - Üretimde kullanılan prokaryot veya ökaryot hücrelerini potansiyel olarak kontamine edebilen bakteri, maya, küf, mikoplazma veya virüsler. Adventif organizmaların potansiyel kaynakları arasında hücre kültürü ortamında kullanılan serum, kalıcı veya geç enfekte olmuş hücreler veya çevre bulunur.

          Afinite - İki molekülün enerji etkileşimini veya bağlanmasını tanımlayan termodinamik miktar, genellikle karşılık gelen antijenik determinantı ile antikorunki.

          ANTİKOR (İMMUNOGLOBÜLİN) - İki tip peptit zincirinden oluşan karakteristik bir yapıya sahip bir protein molekülü: ağır (H) ve hafif (L). Antikorlar, canlı bir türde B-lenfositleri ve plazma hücreleri tarafından bu antikorun üretilmesini indükleyen, bir antijen üzerindeki ilgili determinant bölgesine spesifik olarak uyan ve bu bölgeye bağlanabilen alanlar (bağlanma bölgeleri) içerir.

          ANTİJEN - Genellikle yabancı bir protein veya karbonhidrat olan ve bir organizmaya verildiğinde, yüzey immünokompetan T ve B lenfositleri üzerindeki spesifik reseptörleri aktive eden madde. Antijen ve reseptörler arasındaki etkileşimden sonra, genellikle bir immün yanıtın indüklenmesi, yani antijen üzerindeki determinant sitelerle spesifik olarak reaksiyona girebilen antikorların üretimi olacaktır.

          ANTİJENİK BELİRLEYİCİ - Bir antijenin yapısının, bir bağışıklık tepkisi oluşturacak, yani T ve B lenfositleri üzerindeki reseptörlere uyacak ve ayrıca üretilen antikorlarla reaksiyona girebilecek spesifik kısmı.

          ANTISERUM - Belirli bir antijene (veya immünojene) karşı antikorlar içeren kan serumu. Bu sıklıkla antijen ile aşılanmış bir hayvandan alınan serum anlamına gelir.

          ASCITES - Periton boşluğunda sıvı birikimleri. Monoklonal antikorlar, nakledilen bir hibridom taşıyan farelerin asitlerinden saflaştırılabilir.

          BİRLİK SABİTİ - Antikor ile determinantı arasında, bir afinite ölçüsü içeren bir reaksiyon. Sabit, birleşme ve ayrışma için kütle hareketi kanunu hız sabitleriyle nicelenir. OTORADYOGRAFİ - X-ışını filminde radyoaktif olarak etiketlenmiş moleküllerin tespiti.

          Avidite - Bir antikor molekülünün mevcut tüm bağlanma bölgeleri ile antijen üzerinde bulunan ilgili belirleyiciler arasındaki toplam bağlanma kuvveti.

          BAKTERİYOFAJ - Bakterilere saldıran bir virüs. Lambda bakteriyofajı, rekombinant gen deneylerinde bir vektör olarak sıklıkla kullanılır.

          BAĞLAMA SİTESİ - Antikor molekülünün antijeni spesifik olarak bağlayacak kısmı.

          BİYOAKTİVİTE - Hayvan modeli, hücre kültürü veya in vitro biyokimyasal tahlil ile belirlenen spesifik aktivite veya potens seviyesi.

          BİYOLOJİK KORUMA - Bir organizmanın çevrede hayatta kalmasını ve/veya çoğalmasını sınırlayan özellikleri.

          BİYOLOJİK YANIT DEĞİŞTİRİCİ - Hormonlar, nöroaktif bileşikler ve hücresel düzeyde etki gösteren immünreaktif bileşikler için kullanılan genel terim, biyoteknolojik üretim için olası adaylardır.

          BİOREAKTÖR - Bir biyoteknolojik sürecin merkezi reaksiyonlarının gerçekleştiği bir kap. Tipik olarak kap, kontrollü sıcaklık, havalandırma, karıştırma, asitlik ve sterilite koşulları altında yetiştirilen mikropları içerir.

          BIOSENSORS - Biyolojik kimyasalların (enzimler, antikorlar, DNA) güçlü tanıma sistemleri, vücut sıvılarındaki şekerler ve proteinler (hormonlar gibi) gibi maddelerin, su ve gazlardaki kirleticilerin hızlı ve doğru düşük seviyeli tespitini sağlamak için mikroelektronik ile birleştirilmiştir. havada.

          KALİBRATÖR - Klinik kimyada, bir aleti "kalibre etmek" için kullanılan veya bir standart (kalibratör) eğrisinin yapımında kullanılan standarda genel olarak atıfta bulunan bir terim.

          HÜCRE KÜLTÜRÜ - Çok hücreli organizmalardan izole edilen hücrelerin in vitro büyümesi. Bu hücreler genellikle tek tiptir.

          HÜCRE FARKLILIĞI - Ortak bir ebeveyn hücrenin soyundan gelenlerin yapı ve işlev uzmanlığını elde ettiği ve sürdürdüğü süreç.

          HÜCRE FÜZYONU - Aynı veya farklı türden iki hücrenin kaynaşmasıyla üretilen, farklı hücrelerden çekirdek ve sitoplazma içeren hibrit hücre oluşumu.

          HÜCRE HATTI - In vitro olarak süresiz çoğalma yeteneği kazanan hücreler.

          KEMOTAKSİ - Belirli bileşiklerin konsantrasyon gradyanında net yönelimli hareket. Çeşitli şekerler ve amino asitler cezbedici olarak hizmet ederken asit veya alkali gibi bazı maddeler mikrobiyal kemotakside kovucu görevi görür. Beyaz kan hücreleri ve makrofajlar, lokal inflamatuar reaksiyona ve patojenlere karşı dirence katkıda bulunmak için bakteriyel ürünler, tamamlayıcı proteinler ve antijenle aktive olan T hücrelerinin varlığında kemotaktik hareket gösterir.

          CISTRON - Spesifik bir polipeptidin sentezinden sorumlu olan en küçük genetik materyal birimi.

          KLON - Tek bir ata hücresinden kaynaklanan ve normal olarak aynı genlerin tümünü ifade eden bir hücre dizisi. Bu bir B lenfosit klonuysa, normal olarak aynı antikorları, yani monoklonal antikorları üreteceklerdir.

          CODON - Bir proteinin "inşa edilmesinde" bir amino asidin bileşimini belirleyen ve ayrıca zincir sonlandırma için kodlayabilen DNA veya RNA'daki üç nükleotid bazından oluşan grup.

          KOHESIVE TERMINI - Açıkta (yapışkan) tamamlayıcı bazlarla tek sarmallı uçlara sahip DNA molekülü.

          TAMAMLAYICI DNA (cDNA) - DNA hibridizasyon çalışmalarında klonlama veya prob olarak kullanılan haberci RNA'yı tamamlayıcı olan DNA.

          COSMID - Bir plazmide benzeyen ancak aynı zamanda büyük DNA parçalarının yerleştirilmesine ve bir faja in vitro paketlemeye izin vermek için bakteriyofaj lambdanın kohezif bölgelerini (cos sitesi) içeren bir vektör.

          ÇAPRAZ REAKSİYON - Bir antijen A'ya karşı antikorlar, antijen A'da bulunan belirleyicilerle ortak bir veya daha fazla belirleyiciye sahipse veya antijen A'da bulunan belirleyicilere yapısal olarak çok benzeyen bir veya daha fazla belirleyici taşıyorsa, diğer antijenlerle reaksiyona girebilir.

          SİTOKİN - Yanıt veren hücrelerdeki spesifik reseptörlere bağlandıktan sonra hücreler arası iletişimciler olarak görev yapan monositler ve lenfositler tarafından üretilen küçük, immünoglobulin olmayan proteinler. Sitokinler çeşitli biyolojik aktiviteleri düzenler.

          SİTOPATİK ETKİ - Hücreler bir virüs ile enfekte olduğunda üretilen hücre hatlarının morfolojik değişiklikleri. Sitopatik etkilerin örnekleri arasında hücre yuvarlama ve kümelenme, hücre zarlarının kaynaşması, hücrelerin genişlemesi veya uzaması veya hücrelerin parçalanması yer alır.

          SİTOTOKSİK - Hücrelere zarar verir.

          DENATURASYON - Bir protein molekülünün genel olarak biyoaktif olmayan bir forma açılması. Ayrıca DNA dupleksinin iki ayrı zincire ayrılması.

          DNA (DEOKSİRİBONÜKLEİK ASİT) - Kromozomların temel biyokimyasal bileşeni ve kalıtımın desteklenmesi. DNA şeker deoksiribozu içerir ve (bazı virüsler dışında) genetik bilginin depolandığı nükleik asittir.

          DNA KLONLAMA - Tanımlanmış bir DNA parçasının birçok özdeş kopyasının üretilmesi.

          DNA KÜTÜPHANESİ - Birlikte tüm genomu veya belirli bir dokunun transkripsiyonunu temsil eden klonlanmış DNA parçaları seti.

          DNA POLİMERAZ - Tek sarmallı DNA'dan çift sarmallı DNA sentezini katalize eden bir enzim.

          DNA SENTEZİ - Nükleotid bazlarının sıralı eklenmesiyle DNA oluşumu.

          DNase - DNA'da tek iplikli çentikler üreten bir enzim. Nick çevirisinde DNase kullanılır.

          ELUTION - Bir kolona bağlı bir enzimden bir ürünün çıkarılması gibi bir adsorbandan adsorbe edilen malzemenin çıkarılması.

          ENDONÜLAZLAR - Nükleik asit molekülleri içindeki bağları parçalayan enzimler.

          ENDOTOXIN - Bazı gram-negatif bakterilerin dış zarı ile ilişkili, ısıya dayanıklı bir lipopolisakkarit. Salgılanmaz ve sadece hücreler bozulduğunda salınır. Endotoksinler insanlara enjekte edildiğinde ateşli bir yanıt oluşturarak ölüm dahil ciddi klinik sorunlara yol açar. Mevcut USP Referans Standardı Lot EC-5 ile karşılaştırmalı olarak bir endotoksin birimi (EU) tanımlanır. Bir lot EC-5 flakonu 10.000 EU içerir. Endotoksin için resmi test USP'de bulunur.

          ENZİMLER - Biyokimyasal reaksiyonlarda katalizör görevi gören proteinler.

          EXONUCLEASES - Bir DNA molekülünün uçlarından nükleotitlerin çıkarılmasını katalize eden enzimler.

          FERMENTASYON - Anaerobik bir biyoproses. Fermantasyon, maya, küf ve bakterilerin etkisiyle alkoller, asitler ve peynir gibi ürünlerin üretimi için çeşitli endüstriyel işlemlerde kullanılır. Fermantasyon işlemi, monoklonal antikorların üretiminde de kullanılır.

          PROTOPLAST FÜZYONU - Mikroorganizmaların genetik mirasının yeniden dağıtılmasını mümkün kılan, duvarları yok edilmiş iki hücrenin füzyonu.

          GEN - Belirli bir özelliğin ifadesinde rol oynayan kalıtımın temel birimi. Bir genin ifadesi, içerdiği genetik bilginin bir protein elde etmek için kopyalandığı ve çevrildiği mekanizmadır. Bir gen, belirli bir polipeptit zincirinin sentezini yöneten DNA molekülünün bir parçasıdır. Birçok kodondan oluşur. Gen bu şekilde bir fonksiyon birimi olarak düşünüldüğünde, sıklıkla cistron terimi kullanılır.

          GEN TRANSFERİ - Dölde istenen özellikleri elde etmek için yabancı genleri bir konakçı hücreye sokmak için genetik veya fiziksel manipülasyonun kullanılması.

          GENETİK MÜHENDİSLİĞİ - Canlı bir hücredeki genetik bilgiyi değiştirmek, onu istenen bir amaç için yeniden programlamak için kullanılan bir teknik (doğal olarak üretemeyeceği bir maddenin üretimi gibi).

          GENOM - Bir hücre tarafından taşınan tüm genler.

          GLİKOPROTEİN - Şeker gruplarının bağlandığı protein. İnsan kan grubu proteinleri, hücre duvarı proteinleri ve bazı hormonlar glikoproteinlere örnektir.

          GLİKOSİLASYON - Bir glikoproteinin protein kısmındaki bir amino aside şekerlerin kovalent bağlanması.

          HAPTEN - Karşılık gelen antikorla tek başına reaksiyona girebilen düşük moleküler ağırlıklı bir madde. İmmünojenik olmak için haptenler, moleküler ağırlıkları 5000'den fazla olan moleküllere bağlanır. Bir örnek, digoksin-BSA immünojenini oluşturan sığır serum albüminine kovalent olarak bağlanan hapten digoksin olabilir.

          YÜKSEK AFİNİTE ANTİKOR - Antijen için yüksek afiniteye sahip antikorlar. Bu antikorlar ağırlıklı olarak IgG'dir ve antijene ikincil bir yanıt sırasında üretilir. Yüksek afiniteli bir antikor üreten hücreler, düşük antijen konsantrasyonu ile tetiklenebilir.

          YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ (HPLC VEYA LC) - (Test Yöntemlerine Bakınız)

          HOST - Metabolizması bir virüs, plazmit veya başka bir yabancı DNA formunun büyümesi ve çoğaltılması için kullanılan bir hücre.

          HİBRİDOMA TEKNOLOJİSİ - Bir antikor oluşturan hücre (lenfosit) ve bir malign miyelom hücresi ("ölümsüz") arasındaki füzyon, tek bir spesifikliğe sahip antikorlar üretebilen sürekli büyüyen bir hücre klonu (hibridoma) ile sonuçlanır.

          İMMUNOASAY ÖZGÜRLÜĞÜ - Analit matrisinde bulunabilecek yapısal olarak benzer maddelerle çapraz reaktivite çalışmaları yürütülerek belirlenen bir performans özelliği. Özgüllük çalışmaları, immünoanalizde kullanılan her yeni poliklonal antikor lotu ile belirlenir. Monoklonal antikor için, sonraki her yeni lot, genellikle kapsamlı özgünlük çalışmaları yerine biyokimyasal ve biyofiziksel tekniklerle karakterize edilir.

          İMMUNOELEKTROFOREZ (IEP) - (Bkz. Test Yöntemleri - İmmünodiffüzyon (çift, Ouchterlony teknikleri))

          IMMUNOTOXIN - Toksin parçasını bir hedef hücreye iletebilen toksinlerle birleştirilmiş monoklonal antikorlar.

          IN SITU HİBRİDİZASYON - Doğrudan bir kromozom hazırlığı veya histolojik kesit üzerinde gerçekleştirilen uygun bir prob ile hibridizasyon.

          IN VITRO - Yapay bir sistemde vücut dışında gerçekleşen biyolojik reaksiyonlar.

          IN VIVO - Canlı bir hücre veya organizma içinde gerçekleşen biyolojik reaksiyon.

          İndükleyici - İstenilen ürünün üretilmesine yol açan ifadeyi aktive eden kimyasal veya koşullu bir değişiklik. Düzenleyici bir protein ile etkileşen ve gen transkripsiyonunu tetikleyen küçük bir molekül.

          LİGASE - DNA moleküllerini birleştirmek için kullanılan enzim.

          LOCUS - Bir genin kromozom üzerindeki yeri.

          LENFOKİNLER - Spesifik antijenle reaksiyona girdikten sonra ağırlıklı olarak T-lenfositlerinden salınan maddeler. Lenfokinler biyolojik olarak oldukça aktiftir ve kemotaksiye ve makrofajların aktivasyonuna ve diğer hücre aracılı bağışıklık reaksiyonlarına neden olur. Gama-interferon bir lenfokindir.

          LYSIS - Hücre duvarının parçalanmasının meydana geldiği ve hücresel içeriği çevreleyen ortama bıraktığı süreç. Enfektif faj tarafından bakterilerin yok edilmesi.

          ANA HÜCRE BANK (MCB) - Tek bir kültürün (çoğu durumda, tek bir hücreden genişletilmiş) alikotlarından oluşan ve genetik stabiliteyi sağlamak için kriyojenik olarak depolanan bir hücre tohum partisi. Çalışan bir tohum bankası için kaynak materyal sağlamak için yeterli MCB ampulü olmalıdır.

          MESSENGER RNA (mRNA) - Protein sentezi için şablon görevi gören RNA, kopyalanan genetik kodu DNA'dan protein sentezini yönlendirmek için protein sentezleme kompleksine taşır.

          MİKROHETEROJENİTE - Büyük, karmaşık makromoleküllerdeki, birbiriyle yakından ilişkili ancak aynı olmayan yapılar popülasyonuna neden olan küçük farklılıklar. Protein mikroheterojenitesi birçok kaynaktan kaynaklanabilir: genetik varyantlar, hücrelerdeki proteolitik aktivite, proteine ​​çeviri sırasında, şekerlerin bağlanması sırasında ve ticari üretim sırasında.

          MONOKLONAL ANTİKORLAR - Bir hücresel klon tarafından üretilen ve hepsi aynı olan antikorlar.

          MUTAGENEZ - Araştırmacılar tarafından istenen bir özelliği elde etmek için fiziksel veya kimyasal yollarla genetik mutasyonun uyarılması.

          MUTASYON - Genetik materyalde, tek bir baz çiftinde (nokta mutasyonu) veya kromozomların sayısında veya yapısında bir değişiklik.

          MİYELOMA - Bir lenfositten türetilen tümör hücre dizisi.

          NICK TRANSLATION - Radyoaktif olarak işaretlenmiş nükleotidleri DNA'ya sokmak için kullanılan in vitro yöntem.

          NICK - Bir DNA veya RNA zincirinin şeker-fosfat omurgasında bir kırılma.

          OLİGONÜKLEOTİTLER - Kısa DNA veya RNA segmentleri, yani birkaç nükleotitten oluşan bir zincir.

          OPERATÖR GEN - Bitişik yapısal gen(ler)i açan bir gen.

          OPERON - Düzenleyici gen(ler), kontrol elemanları (promotör ve operatör) ve bitişik yapısal gen(ler)den oluşan eksiksiz bakteri gen ekspresyonu birimi.

          PATOJEN - Genellikle bakteri veya virüs gibi canlı bir ajanla sınırlı hastalık üreten bir ajan.

          PEPTİT BAĞI - Bir amino asidin karboksil (-COOH) grubu ile diğerinin amino (-NH2) grubu arasındaki kimyasal bağ.

          PLAK - Bir faj tarafından parçalanma nedeniyle kaplanmış bir bakteri kültüründe temiz alan.

          PLASMID - DNA plazmitlerinin (ve bazı virüslerin) kromozom dışı, kendi kendini kopyalayan dairesel bir parçası, bakteri "konakçı" hücrelerinde DNA'yı klonlamak için "vektörler" olarak kullanılır.

          POLİKLONAL - Farklı hücre tiplerinden elde edilir.

          PROKARYOTE - DNA'sı bir nükleer zar içinde yer almayan bir organizma (örn. bakteri, virüs, mavi-yeşil algler).

          PROTEİN - Amino asitlerden oluşan bir polipeptit. Biyolojik olarak aktif hallerinde, proteinler metabolizmada katalizör olarak ve bir dereceye kadar hücre ve dokuların yapısal elemanları olarak işlev görürler.

          PİROJENİsite - Bazı bakteri hücrelerinin veya hücre parçalarının vücutta iltihabi reaksiyonlara neden olarak farmasötik ürünler olarak yararlılıklarını azaltabilecek eğilim.

          REKOMBİNANT DNA - Geleneksel üreme deneylerinin aksine genetik mühendisliği yöntemleriyle birleştirilmiş farklı kaynaklardan gelen genleri içeren DNA.

          KISITLAMA HARİTASI - Çeşitli kısıtlama enzim sitelerinin doğrusal düzenlemesi.

          KISITLAMA SİTESİ - Bir enzim tarafından tanınan baz dizisi.

          RETROVİRÜS - Bir DNA dupleksine dönüşerek çoğalan RNA virüsü.

          REVERSE TRANSCRIPTASE - RNA'dan DNA sentezini katalize eden bir enzim.

          RNA (RİBONÜKLEİK ASİT) - Kromozomun esas olarak nükleolus ve ribozomlarda bulunan temel biyokimyasal bileşeni. Messenger RNA, genetik bilgiyi çekirdekten sitoplazmadaki ribozomlara aktarır ve ayrıca polipeptitlerin sentezi için bir şablon görevi görür. Transfer RNA, aktive edilmiş amino asitleri sitoplazmadan haberci RNA'ya aktarır.

          RNA POLİMERAZ - Transkripsiyonda RNA sentezini katalize eden bir enzim.

          SODYUM DODESİL SÜLFAT POLİAKRİLAMİT JEL ELEKTROPOZİS (SDS-PAGE) (Test Yöntemlerine Bakınız)

          STRAIN - Ayırt edici özelliklere sahip, ancak genellikle ayrı bir cins veya çeşit olarak kabul edilmeyen aynı türden bir organizma grubu.

          T- YARDIMCI HÜCRELER - B-lenfositler gibi diğer hücrelerin antikor yapmalarına yardımcı olma özel kapasitesine sahip T-lenfositler. T-yardımcı hücreler, diğer T-lenfosit aktivitelerinin indüklenmesi için de gereklidir. Eş anlamlısı T indükleyici hücre, T4 hücre veya CD 4 lenfosittir.

          T- SUPRESSOR HÜCRELER - T-yardımcı hücre fonksiyonunu inhibe etmek için spesifik kapasiteye sahip T-lenfositler.

          Transkripsiyon - Bir genin kromozomlardaki DNA'dan haberci RNA'ya aktarılan genetik bilgi vasıtasıyla ifade edilmesindeki ilk aşama.

          TERCÜME -Bir genin mRNA'dan protein sentezine aktarılan genetik bilgi vasıtasıyla ifade edilmesindeki ikinci aşama.

          VEKTÖR - Klonlama için yabancı DNA'nın yerleştirilebileceği bir plazmit, faj veya kozmit.

          WESTERN BLOT - (Bkz. Test Yöntemleri).

          ÇALIŞAN HÜCRE BANKASI (WCB) - Ana Hücre Bankasının bir veya daha fazla ampulünden türetilen ve üretim partisini başlatmak için kullanılan bir miktar hücre.


          Ek

          Laboratuvar Hizmetleri

          Döngü başına aşağıdaki sayıda laboratuvar hizmeti tıbbi olarak gerekli kabul edilir.

          Tablo : Döngü Başına Laboratuvar Hizmetleri
          Doğal izleme Clomid izleme Clomid IUI Inj Pzt Döngüsü Inj IUI tüp bebek HEDİYE FET Kodu ÖĞLEDEN SONRA
          transvajinal ultrason 2 6 6 8 10
          östradiol 2 6 6 8 10 10 10 10
          FSH 2 6 6 8 10 10 10 10
          sol 2 6 6 8 10 10 10 10
          progesteron 2 Progesteron için dipnotlar * 2 Progesteron için dipnotlar * 2 Progesteron için dipnotlar * 8 10 10 10 10 3
          hCG 2 2 2 2 2 2 2 2 3

          Anahtar : IUI: intra-uterin tohumlama Inj: enjeksiyon Pzt: aylık IVF: in vitro fertilizasyon HEDİYE: gamet intra-fallop transferi FET: dondurulmuş embriyo transferi PM: gebelik izleme FSH: folikül uyarıcı hormon LH: luteinize edici hormon hCG: insan koryonik gonadotropini .

          Progesteron için dipnotlar *Not: Düzensiz ve uzamış adet döngüsü olan infertil kadınlarda 2'den fazla progesteron ölçümü tıbbi olarak gerekli olabilir. Düzenli adet döngüsü olan kısır kadınlar için, orta luteal serum progesteron ölçümü (28 günlük döngünün 21. günü) tıbbi olarak gerekli kabul edilir. Düzensiz adet döngüsü olan kısır kadınlar için, bu testin luteal fazın ortasında ve ardından bir sonraki adet döngüsü başlayana kadar haftada bir tekrarlanması gerekir.

          Gonadotropinler/Menotropinler (İlk Döngü için Başlangıç ​​Döngüsü Dipnotları *)

          35 yaşından küçük: 20 ampul (FSH seviyesi 12'den büyük ve 19'dan az ise 35 ampule kadar)

          35 ila 39 yaş: 20 ila 30 ampul (FSH seviyesi 12'den büyük ve 19'dan azsa 40 ampule kadar)

          40 yaş ve üstü: 40 ampul (FSH seviyesi 12'den büyük ve 19'dan azsa 50 ampule kadar)

          35 yaşından küçük: 30 ila 40 ampul (FSH seviyesi 12'den büyük ve 19'dan azsa 50 ampule kadar)

          35 ila 39 yaş: 35 ila 45 ampul (FSH 12'den büyük ve 19'dan küçükse 55 ampule kadar)

          40 yaş ve üstü: 45 ila 60 ampul (60 ampulden fazla talepler, FSH seviyesi 12'den büyük ve 19'dan azsa klinik incelemeye tabidir, ilaç protokolü ve klinik inceleme talep edin (BMI, PKOS))

          Donör yumurtaları Donör Yumurtaları için Dipnotlar ** (tüm yaşlar): 30 ila 40 ampul (FSH seviyesi 12'den büyük ve 19'dan azsa 50 ampule kadar)

          Lüteinizan Hormon (İlk Döngü İçin Başlangıç ​​Döngüsü Dipnotları *)

          35 yaşından küçük: 1 ila 10 ampul

          35 ila 39 yaş arası: 10 ila 15 ampul

          40 yaş ve üstü: 15 ila 20 ampul

          35 yaşından küçük: 10 ampul

          35 ila 39 yaş arası: 10 ila 20 ampul

          40 yaş ve üstü: 20 ila 30 ampul

          HCG deri altı enjeksiyonları (İlk Döngü için Başlangıç ​​Döngüsü Dipnotları *)

          HCG kas içi enjeksiyonları (İlk Döngü için Başlangıç ​​Döngüsü Dipnotları *)

          Anahtar: ART: ileri üreme teknolojisi BMI: vücut kitle indeksi FSH: folikül uyarıcı hormon HCG: insan koryonik gonadotropini IU: uluslararası birimler MDV: çoklu doz flakonu PCOS: polikistik over sendromu PFS: önceden doldurulmuş şırınga U: birimler.

          İlk Döngü için Dipnotlar * Yeniden doldurmalar, döngü sayfalarındaki belgelere dayanmaktadır.

          Donör Yumurtaları için Dipnotlar ** Bazı planlara yumurtalık yetmezliği için kısırlık hizmetleri dahil değildir, lütfen fayda planı açıklamalarını kontrol edin.

          Tohumlama Miktarı için Dipnotlar † Rahim içi tohumlama döngüsünün 10 gün boyunca ilaç kullandığını varsayar

          ART Miktarı için Dipnotlar ‡ART döngüsünün 10 gün boyunca ilaç kullandığını varsayar.

          Örnekler için Dipnotlar §Farklı konsantrasyonlar için baz olarak 75 IU kullanın.

          Marka isimleri

          Onay uzunluğu

          450 birim MDV, 1050 birim MDV

          150, 300, 600, 900 birim çok dozlu kartuşlar

          Serum testosteron seviyeleri normalleştikten sonra, Gonal F'yi hCG ile birlikte kullanın: 18 aya kadar haftada üç kez 150 ünite maksimum doz 300 ünite haftada üç kez

          Serum testosteron düzeylerinin normalleşmesinden sonra, Follistim AQ'yu hCG ile birlikte kullanın: haftada 450 ünite (veya haftada iki kez 225 ünite veya haftada üç kez 150 ünite).

          hCG kas içi enjeksiyonları

          Örnekler: Pregnyl, Novarel, hCG

          Haftada üç kez 500-1000 ünite x 3 hafta, ardından haftada iki kez aynı doz x 3 hafta

          6-9 ay boyunca haftada üç kez 4000 ünite, ardından doz, ilave 3 ay boyunca haftada üç kez 2000 üniteye düşürülebilir.

          Follitropin için dipnotlar * Eşzamanlı rekombinant follitropin ve insan koryonik gonadotropin tedavisi, spermatogenezde iyileşme beklenmeden önce en az 3 ila 4 ay sürdürülmelidir.

          Tanımlar

          Bu politikanın amaçları doğrultusunda aşağıdaki tanımlar kullanılacaktır:

          Yumurtlama bozukluklarının sınıflandırılması:

          Anovülasyon ve oligo-ovülasyon, kadın doğurganlık sorunlarının %21'ine neden olduğu tahmin edilen yumurtlama bozukluklarıdır. Dünya Sağlık Örgütü yumurtlama bozukluklarını 3 gruba ayırmaktadır.

          Grup I:
          Grup II :
          Grup III :

          SANAT Döngülerinde Embriyo Kalitesi :

          Bir embriyo %50'den daha az parçalanmaya sahipse makul kalitede (sınıf B veya eşdeğeri) kabul edilir (bkz. , 2013)..

          Tüp Bebek Döngülerinde Döllenme Oranları :

          IVF döngüleri %50'den az döllenmeyle sonuçlanırsa, döllenme oranları zayıf olarak kabul edilir.

          Gonadotropin Stimülasyonuna Yanıt Olarak Yumurtalık Rezervi:

          Gonadotropinlerle over hiperstimülasyonunu takiben 3 veya daha fazla folikül gelişirse ve östrojen seviyeleri 500 mIU/ml'den fazlaysa yumurtalık rezervi normal kabul edilir. Azalmış yumurtalık rezervi, stimülasyon ve alım sırasında 500 mIU/ml'den daha düşük veya 3'ten az olgun folikül bulunan tepe östrojen seviyeleri ile gösterilir.

          Meni Kalitesi ve Miktarı :

          Meni miktarındaki eksiklikler, en az 2 hafta arayla 2 ayrı durumda ejakülat (yıkanmamış numune) başına 10 milyondan az toplam hareketli sperm veya 3 milyondan az toplam hareketli sperm (yıkanmış numune) varsa ciddi olarak kabul edilir. Kruger katı morfolojisine göre %4'ten daha az normal form varsa, semen kalitesindeki eksiklikler ciddi olarak kabul edilir. Geçmişte 2 haftadan daha uzun süre arayla anormal sperm kalitesi veya miktarı ile ciddi erkek faktörü kısırlığı tanımını karşılayan ve ardından normal sperm kalitesi veya miktarı ile sonuçlanan başarılı bir varikoselektomi geçiren erkeklerde ICSI tıbbi olarak gerekli değildir.

          Semen Analizi: Dünya Sağlık Örgütü Referans Değerleri
          • pH: 7.2 veya daha fazla
          • Sperm konsantrasyonu: ml veya daha fazla başına 15 milyon sperm
          • Sperm morfolojisi (normal formların yüzdesi): %4 veya daha fazla
          • Semen hacmi: 1.5 ml veya daha fazla
          • Toplam hareketlilik (ilerleyici hareketlilik ve ilerleyici olmayan hareketlilik yüzdesi): %40 veya daha fazla hareketlilik veya ilerleyici hareketlilik ile %32 veya daha fazla
          • Toplam sperm sayısı: Ejakülat başına 39 milyon spermatozoa veya daha fazla
          • Canlılık: %58 veya daha fazla canlı sperm
          Endometriozis Aşamaları

          Cerrahi olarak, endometriozis evre I-IV (Amerikan Üreme Tıbbı Derneği'nin Gözden Geçirilmiş Sınıflandırması) olabilir. Çeşitli aşamalar şu bulguları gösterir:

          Aşama I (Minimal) -

          Aşama II (Hafif) -

          Aşama III (Orta) -

          Evre IV (Şiddetli) -

          Kaynak: ASRM, 1997'den uyarlanmıştır.


          Nematisidal toksinlerin varsayılan reseptörlerini taramak için bir ön araç olarak RNAi'nin kullanımı Bacillus thuringiensis

          Bacillus thuringiensis bitki paraziti nematodlar için potansiyel bir kontrol ajanıdır. Cry21 tipi toksinler için nematod bağırsak reseptörleri çok az bilinmektedir. Bu nedenle, bir nematidal Bt suşu ve üzerinde RNAi tekniği kullanılarak olası Cry toksin reseptörlerini bulmak için birincil bir tarama aracı olarak bir strateji test edildi. Caenorhabditis elegans. Bağırsak membran proteinlerini kodlayan altı gen seçildi (abt-4, bre-1, bre-2, bre-3, asps-1, abl-1) Cry proteinleri için olası hedefler olarak. Seçilen her genin fraksiyonları PCR ile amplifiye edildi. Amplikonlar, dönüştürmek için L4440 vektörüne klonlandı. E. koli HT155 (DE3) suşu. RNAi besleme yöntemi kullanılarak seçilen genleri susturmak için dönüştürülmüş bakteriler kullanıldı. Susturulmuş genlere sahip nematodlar, diğerleri arasında nematisidal protein Cry21Aa3'ü barındıran Bt suşu LBIT-107 ile test edildi. Sonuçlar, nematodların susturulmuş abt-4 geni genel olarak LBIT-107 suşuna %69.5 ve özel olarak Cry21Aa3 toksinine %79 daha dirençliydi.

          Bu, abonelik içeriğinin bir önizlemesidir, kurumunuz aracılığıyla erişilir.


          Sonuçlar

          Bir deney için gRNA'ların seçimi, kulağa bariz gelen ancak çoğu zaman zor kararlar gerektirebilecek olan hedef dışı etkinliği en aza indirirken, hedefteki etkinliği en üst düzeye çıkarmayı dengelemelidir. Örneğin, genomda gerçekten benzersiz bir siteyi hedefleyen daha az aktif bir gRNA mı yoksa genomun bilinen bir fonksiyonu olmayan bir bölgesinde bir ek hedef bölgesi olan daha aktif bir gRNA mı kullanmak daha iyi olur? Uzun süreli çalışma için kullanılacak kararlı hücre modellerinin oluşturulması için ilki daha iyi bir seçim olabilir. Genetik taramalar yapmak için genom çapında bir kitaplık için, bununla birlikte, ikincisinden oluşan bir kitaplık, bir geni hedefleyen çoklu dizilerin bunu çağırmak için puanlamasını gerektirerek sonuçların yorumlanmasına özen gösterildiği sürece muhtemelen daha etkili olacaktır. bir vuruş geni.

          Bu, gen fonksiyonunu araştırmak için sürekli genişleyen bir araç listesi ile fonksiyonel genomik için heyecan verici bir zamandır. En iyi araçlar yalnızca onları kullanan kişi kadar iyidir ve CRISPR teknolojisinin doğru kullanımı her zaman dikkatli deneysel tasarıma, uygulamaya ve analize bağlı olacaktır.

          Konuk blog yazarımız John Doench'e çok teşekkürler!

          John Doench, Broad Institute'teki Genetik Perturbation Platform'da Ar-Ge Direktörüdür ve CRISPR kaynaklarımızın anlaşılmasını, iyileştirilmesini ve açıklanmasını geliştirmek için birçok Addgenie ile birlikte çalışmıştır. Küçük RNA'ları gerçekten seviyor.


          Videoyu izle: Gen Dizilimi (Mayıs Ayı 2022).