Bilgi

Bir proteinin yukarı regülasyonunun diğerinin aşırı ekspresyonuna yol açıp açmadığı nasıl belirlenir?

Bir proteinin yukarı regülasyonunun diğerinin aşırı ekspresyonuna yol açıp açmadığı nasıl belirlenir?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Yine, biyolojide yeniyim ve bir sürü sorum var. İlgili proteinlere bağlı mı? VEYA bir protein upregülasyonunun tam olarak ne kadarının başka bir proteinin aşırı ekspresyonuna yol açtığını belirlemek için uygulanabilecek temel ortak ekspresyon prosedürleri var mı?


Protein A'nın nedensel bir ilişki olduğunu göstermek için sebep olur B proteinindeki artış, deneysel olarak A seviyesini artırmanız ve B'nin yükselip yükselmediğini ölçmeniz gerekir. Aşırı ekspresyon tipik olarak, yüksek seviyelerde protein sentezine neden olan güçlü bir promotör tarafından tahrik edilen, kodlama dizisini içeren bir plazmitten protein A'nın aşırı ekspresyonu ile yapılır. Bazı işaretçiler için bu Wikipedia sayfasına bakın. Göreceli protein seviyeleri western blotlama ile ölçülebilir. Deneysel ayrıntılar, elbette, hangi hücre tipi ve protein üzerinde çalıştığınıza çok bağlıdır.


IL6'ya kronik sistemik maruz kalma, zebra balığı karaciğerinde glikoliz ve yağ birikiminin düzensizleşmesine yol açar

Alkolsüz Yağlı Karaciğer Hastalığında (NAFLD) iltihaplanma sabittir, ancak ilişkileri belirsizdir. İnsan IL6'sının (IL6-OE) kronik sistemik aşırı ekspresyonuna sahip bir transgenik zebra balığı sisteminde, inflamasyonun intrahepatik trigliserit birikimine neden olabileceğini gösterdik. IL6-OE karaciğerinin transkriptomik ve proteomik analizi, glikoliz/glukoneogenez yolunda bir kuralsızlaştırmayı, özellikle glikolitik enzim aldolaz b'nin çarpıcı bir şekilde aşağı doğru düzenlenmesini ortaya çıkardı. Kütle spektrometrisi ile yapılan metabolomik analiz, trigliserit sentezi için öncü olarak hareket edebilen heksoz monofosfatların ve bunların türevlerinin birikimini gösterdi. Sonuçlarımız, glikoliz/glukoneogenezin, özellikle aldolaz b'nin IL6 tarafından yönlendirilen baskısının, yağlı karaciğer için yeni bir mekanizma olabileceğini düşündürmektedir. Bu mekanizma, Asya Hint popülasyonlarında daha yaygın olan, ortaya çıkan bir NAYKH sınıfı olan zayıf bireylerde NAYKH ile ilgili olabilir.


Tanıtım

Aerobik organizmalar, çeşitli fizyolojik ve metabolik hücresel sinyal ağları aracılığıyla uygun oksijen tedarikini sağlamak için kritik kontrol stratejileri kullanır. Hipoksi olarak adlandırılan hücresel oksijen taleplerini karşılayamama, spesifik hücresel stres tepkilerinin aktivasyonu ile sonuçlanır [1, 2]. Hipoksik stres, hücrenin metabolik ve anjiyojenik yollarını değiştirerek ve oksijen homeostazını geri yükleyerek hücrelerin uyum sağlamasına ve hayatta kalmasına yardımcı olmak için global gen ekspresyonu değişikliklerini indükler [3,4,5,6,7,8,9,10]. Bu onarım ve adaptif mekanizmalar başarısız olursa, hücreler programlanmış hücre ölümünü indüklemek için gen ekspresyon profillerini değiştirir [11,12,13,14,15,16]. Embriyogenez ve gelişim sırasında aktif hipoksi sinyal ağları gerekli olmasına rağmen [17,18,19], hipoksik koşullar ya normal olarak azalır ya da olgun organizmalarda patolojik olaylara katkıda bulunur [20,21,22,23].

Hipoksi sinyalizasyonunun ve anjiyogenezin etkin aktivasyonu, örneğin inme [24], miyokard enfarktüsü [25] ve diğer iskemik olaylardan [26,27,28,29] sonra kritik öneme sahiptir. Alternatif olarak, düşük oksijen seviyelerine metabolik adaptasyon ve ilgili doku revaskülarizasyonu, insan tümörlerinin çoğunun hayatta kalmasına ve ilerlemesine izin verir [30,31,32] ve maküler dejenerasyona [33,34,35,36], glokom progresyonuna katkıda bulunur. [37] ve diyabetik retinopati [38,39,40,41]. Bu nedenle, hipoksi ile ilgili hücresel ağları kullanan terapötik stratejilerin keşfi ve geliştirilmesi, 2019 Nobel Fizyoloji veya Tıp Ödülü'nün Dr. Semenza, Ratcliffe, Kaelin, hücrelerin oksijeni nasıl algıladıkları ve hipoksiye nasıl tepki verdikleri konusundaki araştırmalarında [42,43,44,45,46].

Hipoksiye hücresel yanıtın temel amacı, hücrenin hayatta kalmasını sağlamak ve oksijen homeostazını yeniden sağlamaktır. Ancak bu amaca, protein katlanması ve kaçakçılığındaki bozulmalara yansıyan mitokondri ve endoplazmik retikulum (ER) işlevindeki hücresel organel değişikliklerinin deregülasyonu eşlik eder [4, 47,48,49,50,51,52,53]. Düzensiz protein katlanması, başka bir spesifik stres tepkisi yolunu, katlanmamış protein tepkisini (UPR) aktive eder. UPR, farklı sinyal ağları [54,55,56] aracılığıyla endoplazmik ve mitokondriyal homeostazı geri yükleyerek hücresel sağkalımı destekler, ancak başarısız olursa, UPR hücre ölümünü indükler [57,58,59].

UPR'nin aktivasyonu, hayatta kalan hipoksiyi desteklese de, hücresel sağkalımı da bozabilir [60]. Örneğin ER, proanjiyojenik reseptörleri ve vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) gibi ligandları içeren transmembran ve salgı proteinlerinin [61,62,63,64,65,66,67,68,69] katlanmasından ve olgunlaşmasından sorumludur. ) ve sırasıyla hipoksi ile indüklenen anjiyogenez ve eritropoez için kritik olan eritropoietin (EPO) [70,71,72]. Bu nedenle, yeterince takdir edilmese de, bu stres yanıt yolları arasındaki karşılıklı etkileşimi anlamak, kardiyovasküler hastalıklar ve kanserde terapötik müdahaleleri anlamak ve geliştirmek için önemlidir. Bununla birlikte, bu stres tepkilerinin her ikisi hakkında kapsamlı çalışmalara rağmen, toplu aktivasyonlarının ortaya çıkan sonuçları büyük ölçüde açıklanmamıştır ve esas olarak in vitro hücre kültürü tabanlı modellerle sınırlıdır. Bu derlemede, bu iki hücre hayatta kalma yolunu ve hipoksi hücresel yanıt yolunda UPR katılımının etkilerini özetliyoruz.


Sonuçlar

Hsf4 -/- fare, merceğin perisentrik bölgesinde, kısmen insanı taklit eden anormal lif gelişimi sergiler. HSF4 mutasyon katarakt

HSF4'ün lens oluşumundaki işlevini ayrıntılı olarak incelemek için, farenin hedeflenen bozulmasını oluşturduk. Hsf4 129S3 embriyonik kök (ES) hücrelerinin homolog rekombinasyonu ile gen. Vektörde, DNA bağlama alanını kodlayan ekzonlar 3-5, neomisin dirençli gen ve ardından PGK kaseti ile değiştirildi (Şekil 1A). ES hücreleri (aguti'den türetilen 129S3 suşu), pozitif-negatif seçim [10] altında doğrusallaştırılmış hedefleme vektörü ile elektroporasyona tabi tutuldu ve sekiz doğru hedefleme klonu elde edildi (veriler gösterilmemiştir). Doğru hedeflenen klonlara sahip ES hücreleri, bir C57Bl/6 blastosiste (siyah) enjekte edildi, yavruların genotipleri, vahşi tip (+/+), heterozigot (+/-) ve homozigot (-/-) tanımlamak için PCR ile analiz edildi. ) çeşitleri (Şekil 1B). Beklendiği gibi, fenotiplerin oranı Mendel frekansına uygundu. Hsf4 -/- fareler, katarakt oluşumu dışında tüm gelişim evrelerinde büyük ölçüde normaldir. Yarık lamba tespiti altında, Hsf4 nakavt farede bir katarakt fenotipi gözlemledik (Şekil 1C). Lensin opaklığı Hsf4 -/- fare doğum sonrası erken bir aşamada ortaya çıktı ve yaşla birlikte arttı.

Hsf4 Nakavt, lens anormallikleri ve gelişimsel kusurlar, özellikle şişmiş ve gevşek lif yapısı ile sonuçlanır. (A) vahşi tip Hsf4 lokus, hedefleme vektörü ve homolog rekombinasyonu takip eden alel gösterilmektedir. Hedefleme vektörü, DNA bağlama alanını kodlayan eksonlar 3-5'i bir neomisin direnç geni ile değiştirmek için kullanıldı. (B) Genomik DNA, cDNA ve proteinin analizi Hsf4 gen Hsf4 PCR, RT-RCR ve Western blot analizi ile nakavt fare. Hedeflenen ekzonları çevreleyen PCR primerleri, 2,6 kb ve 1,6 kb bantları amplifiye etti Hsf4-/- ve Hsf4+/+ sırasıyla fareler. Vahşi tip ifadesinin kaybı Hsf4 Hsf4-/- farelerindeki gen, hedeflenen bölge içindeki primerlerden biri ile toplam RNA'nın ters transkripsiyon-PCR'sinden sonra bir PCR ürününün olmamasıyla doğrulandı. Fare Hsf4 proteinine karşı spesifik bir antikor kullanılarak 8 haftalık farelerin lens ekstraktlarının Western blot analizi, Hsf4 proteininin Hsf4-/- farelerinde bulunmadığını gösterdi. (C) Fare merceğinin yarık lamba görüntüleri ve 8 haftalık farelerin mercek nükleer bölge bölümlerinin histolojik incelemesi. Oklar, lensin nükleer bölgelerindeki normal ve gevşek lifleri gösterir. Hsf4+/+, Hsf4+/-ve Hsf4-/- fareler. Bar, 50 um. (NS) Gevşek ve anormal lifleri gösteren SEM görüntüleri Hsf4 nakavt fareler, vahşi tip farelerin normal yapıları ile karşılaştırıldığında. Bar, 500 um yukarıda ve 5 um aşağıda.

yapısı Hsf4 -/- lens lifleri gevşedi ve lens lifi hücrelerinde E15.5 gününde (veriler gösterilmemiştir) ortaya çıkan vakuol benzeri bir boşluk, vahşi tip bozulmamış çekirdeklere kıyasla şiddetli hale geldi, bir ışık mikroskobu altında açıkça görüldü. Ancak lens epitel hücrelerinin liflere farklılaştığı lensin yay bölgesi genellikle normaldi (Şekil 1C). SEM görüntüleri, lenslerdeki gevşek lifleri ortaya çıkardı. Hsf4 vahşi tipteki muadillerinden çok daha az etkileşim gösteren nakavt fareler (Şekil 1D).

HSF4 lensin doğum sonrası olgunlaşması sırasında γ-kristalinlerin, özellikle γS-kristalinin ifadesinde çok önemli bir role sahiptir.

NS Hsf4 -/- fare merceği kırılgandır ve çok daha hafiftir, ancak vahşi tipteki muadili ile karşılaştırıldığında benzer boyuttadır (Şekil 2A). Lens proteinlerinin %90'ından fazlası çözünür formdadır ve memelilerde çeşitli kristalinleri içerir, kristalinler αA ve αB βB1, βB2, βB3, βA3/A1 ve βA4 γA, γB, γC, γD, γE, γF'dir. ve γS. Farelerde, y-kristalinler, olgun lens proteinlerinin ağırlığına en büyük katkıyı yapanlardır. İnsanlarda, β-kristalinler ve γ-kristalinler, biraz daha düşük miktarda α-kristalin ile hemen hemen eşit oranlardadır. Fujimoto et al. yetişkin HSF4-boş farelerde, 2 günlükken bile γ(AF)-kristalin genlerinin belirgin şekilde azalmış ekspresyonunu tespit etti, ancak γ(AF)-kristalin genlerinin ekspresyon seviyeleri, E15.5 HSF4-boş embriyoların lensinde normaldi . HSF4'ün γF-kristalin geninin yukarı akışına bağlandığını göstermek için kromatin IP (ChIP) analizini kullandılar, bu da HSF4'ün γF-kristalin genlerinin ekspresyonunu düzenlediğini düşündürdü [8]. Buna karşılık, Min ve ark. karşılaştırıldığında 10 günlük Hsf4-boş farelerde azalmış ekspresyon gösteren γF-kristalin geni dışında, 1 günlük ila 28 günlük Hsf4-boş farelerde γ-kristalin genlerinde önemli bir azalma gözlemlemedi. vahşi tip farelere [9]. Bu çelişkili sonuçlar, Hsf4-null farelerin yapısındaki farklılıklardan, test edilen farelerin genetik arka planındaki farklılıklardan ve diğer bilinmeyen faktörlerden kaynaklanabilir. Ancak, Min ve ark. ne de Fujimoto ve ark. başka bir önemli kristal protein olan γS-kristalini inceledi. Fare merceğinin olgunlaşması sırasında, γS-kristalin seviyesi beş kat artar, diğer kristal türlerinin yerini alır ve toplam ağırlığın %15'ini oluşturur [11]. Bu bulgu, nakavt ve vahşi tip farelerin merceğinde γ-kristalinlerin (özellikle γS-kristalin) ekspresyonunu incelememize neden oldu. γ-kristalinlerin mRNA ekspresyonunu ölçtük ve transkripsiyonel aktiviteyi test ettik. Hsf4. Onu bulduk Hsf4 -/- fareler, vahşi tip farelere kıyasla doğumdan hemen sonra y-kristalinlerin tüm alt tiplerinin ekspresyon seviyelerini düşürdü ve 8 haftalıkken neredeyse tam bir y-kristalin ekspresyonu yoktu. Yabani tip farelerde, γS-kristalin mRNA seviyesi, γS-kristalinin doğumda toplam γ-kristalinin yalnızca küçük bir oranı olduğunu ve seviyenin, onu 8 haftalıkken ana y-kristalini yapmak için arttığını gösterir (Şekil 2B). ). HSF4 ve γS-kristalin genleri ilk olarak geç embriyonik evrelerde eksprese edilir ve geç embriyonik gelişimde yukarı regüle edilir [12, 13]. γ(A-F)kristalin genleri bir gen kümesinde bulunur ve Sox1 ve Maf tarafından düzenlenir, ancak γS-kristalin geninin (Crygs) düzenlenmesi iyi karakterize edilmemiştir [14-17]. γS-kristalin ekspresyonunun düzenlenmesinde HSF4'ün rolünü daha fazla değerlendirmek için, insan lens epitel hücre hattı SRA01/04'te γS-kristalin mRNA'nın ekspresyonunu aşağıdaki koşullar altında analiz ettik. hHSF4b aşırı ifade [18]. γS-kristalin mRNA ekspresyon seviyesi on kat daha yüksekti. hHSF4b-kontrolden daha fazla ifade eden hücreler (Şekil 2C). γS-kristalin promotör bölgesi, γ(AF)-kristalin promotörlerinden (Şekil 2D) daha az korunmuş bir ısı şoku elemanı (Crygs-HSE) içerdiğinden, HSF4b'nin doğrudan endojen promotörü ile etkileşime girip giremeyeceğini sorduk. CRYGS ifadesini düzenlemektir. Bu hipotezi test etmek için ChIP tahlillerini kullandık. Bir anti-HSF4b antikoru ile HSF4b eksprese eden SRA01/04 hücrelerinden hazırlanan çözünebilir kromatinin immünopresipitasyonunu, CRYGS promotör bölgesindeki potansiyel HSF4b-bağlanma bölgesini hedefleyen primerler kullanılarak PCR takip etti. PCR, HSF4b ifade eden hücrelerde beklenen bandı verdi ve normal keçi IgG kontrolü için bant yok (Şekil 2E). Ek olarak, HSF4b'nin bağlanacağını varsaydık. CRYGS-HSE, γS-kristalin transkripsiyonunu aktive eder. Bu varsayım altında, CRYGSyS-kristalin geninin bir yukarı akış dizisini içeren -luc vektörü oluşturuldu ve aşırı ekspresyonu olan ve olmayan lusiferaz aktivite seviyeleri HSF4b SRA01/04 hücre hattında belirlendi. aşırı ekspresyonu ile nispi lusiferaz aktivitesi HSF4b aşırı ifade olmaksızın sisteminkinden yaklaşık altı kat daha büyüktü. baskın-negatif HSF4bDNA bağlama alanını kaybetmiş olan HSF4b, lusiferaz aktivitesi üzerinde önemli bir etkiye sahip değildi (Şekil 2F). Bu sonuçlar gösteriyor ki HSF4b bağlanarak γS-kristalin ekspresyonunu düzenleyebilir. ağlar-SEÇ.

lens gelişimi sırasında γ-kristalin ifadesi. (A) 8 haftalık vahşi tipte lens ağırlığı ve Hsf4 Nakavt fareleri. Ortalama ağırlığı hesaplamak için on vahşi tip lens ve 16 nakavt lens kullanıldı. (B) tüm y-kristalinlerin mRNA seviyeleri, nicel RT-PCR kullanılarak analiz edildi. Yenidoğanlarda ve 8 haftalık farelerde lenslerden izole edilen mRNA (C) Spesifik primerler kullanılarak yS-kristalinin mRNA seviyelerinin gerçek zamanlı PCR analizi. Toplam RNA, sırasıyla HSF4b, HSF4 için shRNA veya HSF4 için HSF4b artı shRNA ile transfekte edilmiş insan lens epitel hücrelerinden (SRA01/04) izole edildi. (NS) Yedi y-kristalinin promotör dizisi hizalaması. Klasik ısı şoku elemanı (HSE) dizisiyle aynı olan diziler kırmızı ile gösterilmiştir. Yıldız işaretleri, ısı şoku faktörü bağlanması için gerekli olan anahtar nükleotidleri gösterir. (E) CRYGS gen promotörü, HSF4b ile transfekte edilmiş insan lens epitel hücrelerinden (SRA01/04) kromatin immünopresipitasyonla zenginleştirilmiş DNA'dan PCR ile büyütüldü. (F) İnsan lens epitel hücrelerinde HSF4a veya HSF4b ile transfeksiyon yoluyla promotör-lusiferaz yapısının (CRYGS-luc) nispi lusiferaz aktivitesi (SRA01/04). Transfeksiyonlar hekzapletlerde yapıldı ve normalizasyon kontrolü olarak Renilla lusiferaz plazmidi kullanıldı. Sonuçlar standart sapmalı ortalamalar olarak gösterilmiştir. Pozitif kontrol olarak klasik HSE-luc kullanıldı.

γS-kristalin mutantı rncat γS-kristalin geninin ekson 3'ünde 489. pozisyonda G'den A'ya geçiş noktası mutasyonuna sahip resesif bir katarakt fare modelidir [19]. heterozigot olarak rncat fareler, lens neredeyse normaldir. Sonuçlarımız, HSF4'ün γS-kristalin geninin ekspresyonunu düzenlediğini gösterdi (Şekil 2). Eğer bu doğruysa, HSF4 eksikliği vahşi tip γS-kristalin üretimini azaltacak ve katarakt gelişimini kolaylaştırabilir. Referans olarak, lensin opaklığı rncat fare, nükleer bölgede 11 günlükken ortaya çıktı [19]. İlginç bir şekilde, çaprazladığımızda Hsf4 -/- fare ile rncat fare, yavru (Hsf4 -/- /rncat/+) lensin arka kısmında katarakt gelişti, oysa lensin lensleri Hsf4 +/+ /rncat/+ fareler temelde temiz kaldı (Şekil 3A). Çift boşta katarakt Hsf4 -/- /rncat/rncat fareler daha erken gelişti, 7 günlükken ortaya çıktı ve öncekinden daha şiddetli görünüyordu. Hsf4 +/+ /rncat/rncat fareler (Şekil 3A). Hsf4 eksikliği, γS-kristalin mutasyonlu fare rncat'te lens lifi kusurunu kötüleştirir [bkz. Ek dosya 1]. γS-kristalinin mRNA seviyeleri Hsf4 -/- /rncat/+ ve Hsf4 -/- /rncat/rncat fareler ile karşılaştırıldığında% 90'dan fazla azaldı Hsf4 +/+ ve rncat/rncat fareler (Şekil 3B). Bir dereceye kadar, sonuçlarımız ayrıca şunu gösteriyor: Hsf4 bozulma azalır ağlar Bu tür intercrosslarda yavrularda katarakt oluşumu ile birlikte ekspresyon.

Intercross Hsf4 nakavt fare ve rncat fare. (A) Farklı genotip bileşimlerine sahip farelerin yarık lamba katarakt değerlendirmesi. Eksiklik Hsf4 heterozigot ve homozigotta daha şiddetli bir fenotip indükledi rncat fareler. (B) γS-kristalinin mRNA seviyeleri Hsf+/+, rncat/rncat, Hsf4-/-/rcat/rncat, ve Hsf4-/-/rncat/+ fareler, yarı nicel RT-PCR ile analiz edildi.

Ara filament genleri (Bfsp1/2) Hsf4 -/- farenin merceğinde aşağı regüle edilir

önemli bir yönü Hsf4 -/- Katarakt oluşumu, kristalin regülasyonu ile tam olarak açıklanamayan lens liflerinin anormal gelişimidir. Lensin gevşek lif yapısı Hsf4 nakavt fare buna benzer Bfsp1/2 nakavt fare. nakavt Bfsp1 veya Bfsp2 lifler arasında daha az bağlantı proteini olan gevşek bir lif yapısı ile sonuçlanmıştır [20, 21]. Bu nedenle, seviyelerini ölçtük. Bfsp1 ve Bfsp2 merceğindeki mRNA Hsf4 Nakavt fareleri. Doğumda, seviye Bfsp2 içinde mRNA Hsf4 nakavt fareler, vahşi tip farelerin yarısı kadar iken, Bfsp1 mRNA, vahşi tip farelerinkine benzerdi. 8 haftalıkken, her ikisinin de seviyeleri Bfsp1 ve Bfsp2 merceğindeki mRNA Hsf4 nakavt fareler, vahşi tip farelere kıyasla yedi kattan fazla azalmıştır. Bfsp1 doğumda mRNA (Şekil 4A). 129S3 suşu faresinin, ekson 2'nin kaybına neden olan bir delesyona sahip olduğu öne sürülmüştür. Bfsp2 mRNA ve mRNA seviyelerini önemli ölçüde azaltır. Bfsp2. Bu suştaki Bfsp2 proteini, vahşi tip proteinin antiserumları tarafından saptanamadı [22, 23]. Hsf4 -/- farelerinden beklenen PCR ürün boyutunu, silme bölgesinden primerler kullanarak elde ettiğimiz için Bfsp2 gen (Şekil 4B), C57BL/6J'nin en az bir kopyası var Bfsp2 allel Hsf4 -/- fare. Rağmen Hsf4 -/- fareler, yüksek oranda ifade edilen C57BL/6J Bfsp2 alelinin en az bir kopyasını taşır, Hsf4 -/- fareler, 129S3 vahşi tip farelere kıyasla çok daha düşük bir Bfsp2 ekspresyonu seviyesine sahipti. Bu nedenle, Hsf4'ün olmaması, Bfsp2'nin azaltılmış ekspresyonu ile sonuçlanır.

HSF4 merceğe özgü boncuk filamentlerini düzenler Bfsp1 ve Bfsp2. (A) mRNA seviyelerini belirlemek için gerçek zamanlı PCR Bfsp1 ve Bfsp2 yenidoğan ve yetişkin vahşi tip lenslerde ve Hsf4 Nakavt fareleri. (B) PCR analizi Bfsp2 gen silinmesi Hsf4 -/- , Hsf4 +/- , 129S3 ve C57BL/6J fareleri, 129S3 farelerinde Bfsp2 geninin silinmiş bölgesinden primerler kullanılarak. Sonuçlar, C57BL/6J Bfsp2 alelinin en az bir kopyası olduğunu göstermektedir. Hsf4 -/- fare. (C) SRA01/04'ün HSF4b, HSF4 için shRNA veya HSF4b artı HSF4 için shRNA ile transfeksiyonundan sonra Bfsp1 ve Bfsp2'nin mRNA seviyelerinin gerçek zamanlı PCR analizi. (NS) Promoter dizisi hizalaması Bfsp1 ve Bfsp2. Klasik ısı şoku elemanı (HSE) dizisiyle aynı olan diziler kırmızı ile gösterilmiştir. Yıldız işaretleri, ısı şoku faktörü bağlanması için gerekli olan anahtar nükleotidleri gösterir. (E) Bfsp1 ve Bfsp2 gen promotörleri, HSF4b ile transfekte edilmiş insan lens epitel hücrelerinden (SRA01/04) kromatin immünopresipitasyonla zenginleştirilmiş DNA'dan PCR ile büyütüldü. (F) İnsan lens epitel hücrelerinde HSF4a veya HSF4b ile transfeksiyondan sonra promotör-lusiferaz yapılarının (Bfsp1-luc veya Bfsp2-luc) nispi lusiferaz aktiviteleri (SRA01/04). Transfeksiyonlar hekzapletlerde yapıldı ve normalizasyon kontrolü olarak Renilla lusiferaz plazmidi kullanıldı. Sonuçlar standart sapmalı ortalamalar olarak gösterilmiştir. Pozitif kontrol olarak klasik HSE-luc kullanıldı.

aşırı ifadesi hHSF4b SRA01/04 hücrelerinde yukarı regüle edilmiş transkripsiyon Bfsp1 ve Bfsp2ve bu yukarı regülasyon, özellikle kısa firkete RNA (shRNA) hedeflemesi ile engellenebilir. HSF4b (Şekil 4C). Her ikisi de Bfsp1 ve Bfsp2 promotörler daha az korunmuş HSE dizisine sahiptir (Şekil 4D), HSF4 promotör bölgesini doğrudan bağlayabilir Bfsp1 ve Bfsp2. ChIP tahlillerini kullandık ve promotor dizilerinin beklenen bantlarını tespit ettik. Bfsp1 ve Bfsp2 HSF4b'yi eksprese eden hücrelerdeki genler (Şekil 4E). Bu sonuç, HSF4'ün promotor bölgelerine bağlanabileceğini göstermektedir. Bfsp1 ve Bfsp2 genler. olup olmadığını değerlendirmek için çift lusiferaz sistemini kullandık. HSF4 ifadesini aktive eder Bfsp1 ve Bfsp2. İnsan Bfsp1-luc veya Bfsp2-luc vektörleri, birlikte veya onsuz birlikte transfekte edildi HSF4b SRA01/04 hücrelerine. bağıl lusiferaz aktiviteleri HSF4b ile birlikte transfekte edilmiş Bfsp1-luc veya Bfsp2-luc ile transfekte edilen hücrelerin yaklaşık sekiz katıydı. Bfsp1-luc veya Bfsp2-luc yalnız (Şekil 4F). Bu sonuçlar, HSF4'ün spesifik olarak aşağıdakilere bağlanabileceğini göstermektedir. Bfsp1-SEÇ/Bfsp2-HSE dizileri ve ara filament proteinlerinin ekspresyonunu düzenler Bfsp1 ve Bfsp2.

HSF4 -/- lens bileşenlerinin 2D elektroforetik analizi

Lens bileşenlerindeki değişiklikleri analiz etmek için HSF4 -/- fareler, 8 haftalık bebeklerden lens lizatlarının haritalarını oluşturmak için 2D elektroforetik (2D-E) analizi kullandık. Hsf4 -/- ve vahşi tip (129S3) fareler ve tandem kütle spektrometrisi (MS/MS) ile sıvı kromatografisi (LC) kullanılarak seçilen noktalar tanımlandı. Fare merceğinin yayınlanmış 2D-E haritaları [11, 24] ile karşılaştırıldığında, her ikisinin de 2D-E haritalarındaki kristal proteinlerin çoğunu tanımlamak mümkün oldu. Hsf4 -/- ve vahşi tip fareler. lensi Hsf4 -/- ve vahşi tip fareler genellikle gümüş boyama ile benzer 2D-E protein ekspresyon paternlerine sahipti. Ancak, 2D-E haritasında bazı noktalarda değişiklikler gözlendi. Hsf4 -/- genellikle vahşi tip lensten daha az kristalin proteine ​​​​sahip olan lens (Şekil 5A). Mercek haritasında bazı değiştirilmiş noktalar seçtik ve belirledik. Hsf4 -/- fareler, burada sinyallerin bulunmadığı veya vahşi tip farelerdekinden daha zayıf olduğu (Şekil 5B). İlginç bir şekilde, 21 noktanın 5'i MS tarafından αA-kristalin olarak tanımlandı. Bu aA-kristalin molekülleri, 15-25 kDa'lık bir moleküler kütleye sahipti ve 2D-E jelin asidik bölgesine (PI 4.5-6.0) göç etti. Diferansiyel olarak ifade edilen diğer noktalar, aB-kristalin, βA1-kristalin, βB2-kristalin, yC-kristalin, yB-kristalin, ısı şoku proteini 27 ve 7 bilinmeyen protein olarak tanımlandı. Sınırlı miktarda numune nedeniyle, seçilen noktaların terminal dizileri karakterize edilmedi. Farelerde yaşlanma veya kataraktogenez sırasında benzer bir patern rapor edilmiştir [24]. αA-kristalinin kesilmesine muhtemelen kalpainler olarak bilinen, Lp82 veya kalpain2 [25, 26] gibi 'kırpma' aktivitesi olan kalsiyumla aktive olan proteazların bir sınıfının aktivasyonu neden olur. laboratuvar ortamında. Lensteki Lp82 ve kalpain2 mRNA'larının seviyelerini belirlemek için gerçek zamanlı PCR kullandık. Hsf4 nakavt fareler ve vahşi tip fareler. Hsf4 nakavt neonatal farelerde Lp82 ve kalpain2'nin mRNA seviyeleri, vahşi tip farelere kıyasla dört kat azaldı, bu azalma 8 haftalık farelerde daha da fazlaydı (Şekil 5C). Bu nedenle, αA-kristalin kaybı ve Lp82 ve kalpain2'nin azalmış ifadesi ile ilişkili olabilir. Hsf4 bozulma.

Hsf4 nakavt fare, merceğe özgü αA-kristalin modifikasyonundan yoksundur. (A) 8 haftalık lens proteinlerinin 2D elektroforez haritası Hsf4 -/- ve Hsf4 +/+ fareler. Kutulu bölgelerde iki 2D jel arasında bariz farklılıklar vardır. arasındaki en farklı yoğunluk noktaları Hsf4 -/- ve Hsf4 +/+ fareler kırmızı dairelerle gösterilir. (B) Panel A'daki kutulu bölgelerin yüksek çözünürlüklü görüntüleri, lenslerdeki post-translational modifikasyon αA-kristalin noktalarının kaybını gösteren görüntüler. Hsf4 -/- fareler. Hsf4-/- farelerinde, 2D jelde bazı aA-kristalin kesilmiş fragmanlar eksikti. Proteinler, LC/MS dizilimi ile tanımlandı. Oklar, kesilmiş αA-kristalinlerini gösterir. (C) Yenidoğan ve yetişkin vahşi tipte kalpain2 ve Lp82 mRNA düzeylerini belirleyen gerçek zamanlı PCR ve Hsf4 Nakavt fareleri.


Sonuçlar

Stres tedavisi, zaman içinde çeşitli tepkileri tetikler

Dinamik bir sistemdeki mRNA ve protein ekspresyon yanıtının katkılarını karşılaştırmak için, ER stresine maruz kalan memeli hücrelerinin zaman içinde bir deneyi tasarladık. HeLa hücrelerini 30 saatlik bir süre boyunca 2,5 mM DTT kaynaklı ER stresine maruz bıraktık, sekiz zaman noktasında (0, 0,5, 1, 2, 8, 16, 24 ve 30 saat) örnekleme yaptık (Ek Şekil S1). Bu kurulumda, DTT'nin yarı ömrü

4 sa (Ek Şekil S2). Tedaviye yanıt olarak hücresel fenotipi karakterize etmek için ilk önce bir dizi tahlil gerçekleştirdik (Şekil 1A, Ek Şekil S3). Örneğin, zaman süreci birden fazla hücreyi kapsadığından,

24 saat, hücre yoğunluğundaki değişikliklerle ölçüldüğü gibi stresin hücre çoğalmasını nasıl etkilediğini test ettik. Hücre yoğunluğu ilk 16 saat boyunca azaldı, ardından arttı, bu da hücre popülasyonunun bir kısmının apoptoz geçirdiğini, hayatta kalan hücrelerin normal şekilde çoğaldığını düşündürdü (Şekil 1A, üst panel).

Şekil 1. Hücreler, DTT tedavisine karmaşık bir yanıt verir

  1. Hücre yoğunluğu değişikliklerine, DNA içeriğinin dağılımına ve aktif mitoz derecesine bağlı olarak aktif hücre bölünmesinin derecesini tahmin ettik. Üst panel: Çubuk grafikler, ortalama ve standart sapmalarla birlikte canlı hücre sayılarını gösterir. Siyah çizgiler, DTT tedavi süresi. Orta panel: Farklı süreler için DTT ile tedavi edilen hücreler için DNA'nın propidium iyodür boyaması kullanılarak akış sitometrisi ile hücre döngüsü fazlarının kantitatif analizi. Tüm zaman noktalarında 2N, 4N tepe noktaları ve S-fazı platosu gözlendi ve bu, aktif hücre bölünmesini düşündürdü. Alt panel: İmmünofloresan deneyleri mitotik çekirdekleri kırmızı (anti-fosfo-histon H3 (Ser10) antikoru) ve diğer çekirdekleri mavi (DAPI) olarak gösterir. Tüm deney boyunca mitotik çekirdekler gözlendi. Mitotik sayısı ve tüm çekirdekler arasındaki oran, tüm stres fazları arasında benzerdi (gösterilmemiştir). Beyaz oklar, apoptotik çekirdekler. Tüm deneyler üç kopya halinde yapıldı. Tam veriler Ek Şekil S3'tedir.
  2. mRNA ifadesi değişikliklerinin fonksiyon zenginleştirmesinin özeti (FDR < 0.05, *P < 0,001, **P < 0.0001 ve ***P < 0,00001). Karşılık gelen ifade verileri Ek Şekil S5'te gösterilmektedir. Bir miktar apoptoz meydana gelirken, kalan hücreler yoğun katlanmamış protein ve ER stres yanıtına maruz kaldı.

Bu yorum, hücre döngüsü ilerlemesini ve apoptozu izleyen deneylerle doğrulandı: Deneyin ilk iki saatinde apoptoz meydana gelirken, daha sonraki zaman noktaları, çoğunluk hücrelerinin bölünmeye devam ettiğini gösterdi (Şekil 1A, orta/alt panel Ek Şekil S3). Akış sitometrisine bağlanan DNA etiketlemesi, apoptozun 2 saatte zirveye ulaştığını gösterdi.

Hücre ölümünün %45'i. Özellikle, mRNA için numune hazırlama ve protein analizi hücresel kalıntıları attı, bu nedenle aşağıdaki sonuçlar canlı hücrelere odaklandı. Aynı deney, popülasyonun çoğunun aktif mitoz geçirdiğini de gösterdi: Beklendiği gibi, tüm deney boyunca çoğu hücre G1 aşamasındaydı ve bazı hücreler DNA sentezine devam etti (Şekil 1A orta panel). Bu sonuç, mitoz belirteci olarak anti-fosfo-histon H3 (Ser10) antikoru kullanılarak immünositokimya ile doğrulandı. Stresli ve kontrol grupları, G2/M kontrol noktası ve aktif hücre bölünmesinin M fazı boyunca dağılıma göre çok benzerdi (Şekil 1A, alt panel). Özetle, deneyin erken safhasında hücre kaybı yaşarken, hayatta kalan hücre popülasyonu tüm zaman süreci boyunca bölünmeye devam etti.

Genom çapında transkriptomik ölçümler bu görüşü doğruladı ve uyumlu değişikliklerin gerçekleştiği tepkinin kabaca üç aşamasını gösterdi: erken (<2 sa), orta düzey (2-8 saat) ve geç (> 8 h) (Şekil 1B, Ek Şekil S5). Transkripsiyon regülasyonu ve programlanmış hücre ölümü ile ilgili genler, erken faz sırasında önemli ölçüde yukarı regüle edildi (FDR < 0.05). Ara faz sırasında, ER stresi ve UPR ile ilgili genler yüksek oranda eksprese edilirken, aynı zamanda, translasyon uzaması, RNA eklenmesi ve taşınması ve makromoleküler kompleks montajı ile ilgili genler baskılandı, bu da stresli hücrelerin temel hücresel fonksiyonları bir duruma getirdiğini düşündürdü. dur (FDR < 0.05). Geç faz sırasında hücreler, protein ubiquitination, lizozom ve glikoprotein ve transmembran protein sentezinde yer alan genleri eksprese etti, bu da hayatta kalan hücrelerin geri kazanıldığını gösterir (FDR < 0.05). Lizozomal proteinlerdeki artış, UPR'nin hayatta kalma yanlısı bir tepkinin parçası olarak lizozomu yeniden şekillendirdiğini bulan gözlemlerle tutarlıdır (Ron & Hampton, 2004 Sriburi). ve diğerleri, 2004 Biracı ve diğerleri, 2008 ve diğerleri, 2013 ).

Entegre transkriptom ve proteom oldukça dinamiktir

Daha sonra, transkriptomik verileri tamamlamak için büyük ölçekli, nicel bir proteomik analiz gerçekleştirdik. Çeşitli testler, proteomik verilerin kalitesini doğruladı, örneğin, seçilen proteinlerin Western blotları ve temizlik genlerinin analizi ve bunun iki biyolojik kopya boyunca tekrarlanabilirliği (Ek Şekiller S11 S12 ve S13). Tüm zaman noktalarında en az bir kez toplam 3.235 proteini nicelendirdik ve çoğaltır ve daha fazla analiz için her iki kopyada tam zaman serisi ölçümleri ile 1.237 proteinden oluşan yüksek güvenilir bir veri kümesi seçtik. Bu yüksek güvenilirliğe sahip veri kümesi, boyut olarak yakın zamanda yapılan bir çalışmanınkiyle karşılaştırılabilir (Jovanovic ve diğerleri, 2015 ). Ayrıca benzer sonuçlar gösteren 2.131 protein içeren genişletilmiş bir veri seti oluşturduk (Ek Şekil S19).

Yüksek güvenilirliğe sahip veri seti, ölçüm gürültüsünü gidermek için daha fazla işlendi ve ardından aşağıda açıklanan analizler için kullanıldı. Protein konsantrasyonları, diğer büyük ölçekli çalışmaların gözlemlediğine benzer şekilde (Ek Tablo S1) yaklaşık beş büyüklük sırasını kapsar (Schwanhausser ve diğerleri, 2011 ). Tekrarlanabilirlikleri yüksekti (r Sekiz zaman noktasından yedisi için > 0.94, Ek Şekil S10) karşılık gelen mRNA konsantrasyonları ile korelasyon numuneler arasında tutarlıydı (Ek Şekil S13). Entegre ve kümelenmiş mRNA'nın ısı haritaları ve protein ekspresyon değerleri, genel ekspresyon değişikliklerinin iki biyolojik kopya arasında benzer olduğunu gösterir (Şekil 2, Ek Şekiller S5, S9 ve S14), ancak bazı tutarsızlıklar mevcuttu. Bazı durumlarda, bir kopyada 2 saatte ve diğerinde 8 saatte pik ifade değişiklikleri meydana geldi. Deneysel tekrarlanabilirliği tanımlamak için, normalize edilmiş, log-dönüştürülmüş RNA ve protein konsantrasyonlarının tekrarlanan zaman serisi ölçümleri arasındaki Pearson korelasyon katsayısını listeleyen bir kopya tutarlılık ölçüsü (RCM) hesapladık. Toplam sekiz veri noktasında, bir Pearson korelasyon katsayısı > 0.7, bir P-değer = 0.05. Örneğin, GRP78 için, RCM 0.87/0.97'dir ve bu, iki biyolojik kopya arasında yüksek tekrarlanabilirlik olduğunu gösterir. Ek Şekil S13, tüm RCM değerlerinin frekans dağılımlarını gösterir ve yüksek değerlere doğru bir sapma gösterir.

Şekil 2. RNA ve protein ekspresyonu değişiklikleri oldukça dinamiktir

Şekil 2'de benzer ifade değişikliklerine sahip birkaç ana grup belirledik. Örneğin, genel stres tepkisine dahil olan genler, deneyin orta ve geç fazı sırasında hem mRNA hem de protein seviyesinde önemli ölçüde yukarı regüle edildi (Ek Şekil S14). Çeviri ile ilgili ve mitokondriyal genler, stresli hücrelerin metabolik süreçlerinde bir durma ile tutarlı olarak mRNA seviyesinde aşağı regüle edildi, ancak bu proteinler protein seviyesinde yukarı regüle edildi.

İstatistiksel bir araç, gizli düzenleyici sinyalleri tanımlar

Aşağıda açıklanan sonuçlarda, RNA ve protein zaman serisi verilerinden düzenleyici sinyalleri çıkarmak için PECA aracını kullandık. İlk olarak, PECA sonuçlarının yorumlanmasını göstermek için, ER stresi tarafından indüklenen bir ER şaperonu ve UPR'nin önemli bir anti-apoptotik, hayatta kalma yanlısı bileşeni olan GRP78 (HSP5A) örneğini gösteriyoruz (Şekil 3). Şekil, GRP78'in mRNA ve protein konsantrasyonlarını ve RNA ve protein seviyesi oran oranlarına ve önemine göre PECA sonuçlarını gösterir (RCM = 0.87/0.97). Tedavi boyunca GRP78'in mRNA ve protein ekspresyon paternlerinin birbirinden çok farklı olduğunu görüyoruz: mRNA konsantrasyonları 8 saatte zirve yaptı ve sonrasında azaldı, protein konsantrasyonları ise sürekli arttı. Konsantrasyon verilerine benzer şekilde, GRP78 için RNA oranı oranları iki ila sekiz saat arasında zirve yaptı ve daha sonra azaldı, protein oranı oranları ise başlangıçta düştü ve ara ve geç faz boyunca tedavi öncesi seviyesine yükseldi, bu da sürekli olarak artan protein konsantrasyonuna neden oldu. . PECA, sırasıyla erken ve geç fazda RNA ekspresyonunun hem önemli regülasyonunu hem de deneyin geç fazında önemli bir protein seviyesi regülasyonunu tanımladı (FDR < 0.05 Şekil 3, gölgeli alan).

Şekil 3. PECA, RNA ve protein düzeyinde düzenleyici bilgileri çıkarmak için ifade verilerini çözer

Önemli olarak, PECA, yalnızca konsantrasyon verilerinin incelenmesiyle neyin görünmediğini tespit etti: Yaklaşık 16 saat sonra, RNA ekspresyonu önemli ölçüde aşağı regüle edildi, ancak protein konsantrasyonları yükselmeye devam etti. Bu artış, artan translasyon veya protein stabilizasyonu yoluyla protein ekspresyonunun yukarı regülasyonu yoluyla gerçekleştirildi ve PECA bu düzenleyici olayı hassas bir şekilde tanımladı. Özellikle, PECA, protein seviyesindeki bu yukarı düzenlemeyi, yalnızca önceki zaman noktalarında mevcut mRNA'ların sürekli translasyonundan kaynaklanan protein konsantrasyonlarındaki bir artıştan ayırt edebildi ve düzenlemeyi önemli bir sorun olarak tanımladı. değiştirmek Bir zaman aralığından diğerine sentez ve bozunma oranlarında. Bu düzenleyici olay aynı zamanda RNA ve protein seviyesi düzenlemesinin bazen dengeleyici etkilerinin bir örneğidir (aşağıda ve Ek Şekil S16'da tartışılmıştır). Genel veri özelliklerini ve ölçüm gürültüsünü bir araya getiren PECA, düzenleyici olayları nicelleştirmemize ve bunları sistematik ve istatistiksel olarak tutarlı bir şekilde çıkarmamıza olanak sağladı. PECA sonuçlarının tamamı Veri Kümesi EV1'de sağlanır.

Protein konsantrasyonu değişiklikleri daha büyük ölçüde meydana gelir, ancak her iki düzenleyici düzey de eşit ve bağımsız olarak katkıda bulunur.

Genel PECA sonuçlarını tartışmadan önce, entegre mRNA ve protein konsantrasyonu verilerinin genel özelliklerini inceledik (Şekil 4A–D). Genel olarak, hem protein hem de mRNA konsantrasyonları deneyin erken safhasında pek değişmedi, fakat farklı dinamiklerle orta ve geç safhada değişti. Daha önceki çalışmalarla tutarlı olarak (Murray ve diğerleri, 2004), transkriptom, yaklaşık 1.5 katlık ortalama değişikliklerle, deneyimizde nispeten statikti. Transkript konsantrasyonları, 8 saatte kararlı durumdan maksimum olarak ayrıldı, ardından orijinal seviyelere döndüler. Buna karşılık, protein konsantrasyonları, geç fazda çok daha az değişiklikle, deneyin başından sonuna kadar sürekli olarak farklılaştı (Şekil 4, Ek Şekil S15). Değişimin büyüklüğü, mRNA'lardan daha büyük olan ekspresyon kat değişikliklerinin ortalama (ve aralığı) ile gösterildiği gibi, proteinler için mRNA'lardan daha belirgindi (Şekil 4, Ek Tablo S1).

Şekil 4. ER stresi sırasında proteom yanıtı baskındır

  • A, B. Korelasyon (Pearson's r 2) 0 zamanındaki normalleştirilmiş, mutlak ifade değerleri ve ilgili zaman noktaları arasında.
  • C, D. Ortalama kat değişimi (log tabanı 10) ve normalleştirilmiş, göreli ifade değerlerinin standart sapması.
  • E, F. PECA tarafından belirlendiği gibi önemli ölçüde düzenlenmiş genlerin sayısı (FDR < 0.05). Üç fazın her birinde zaman noktalarında maksimum olasılığı seçerek her bir genin CPS olasılıklarını özetledik; bu, ifade düzenlemesinin (hız oranı) faz aşama nasıl değiştiğini karakterize etmemizi sağlar. E, I ve L etiketleri sırasıyla erken, orta ve geç aşamayı işaretler.

Bu sistemdeki hücresel yanıta iki düzenleyici seviyenin katkısını ölçmek için, PECA sonuçlarına %5 FDR kesme uygulayarak önemli ölçüde düzenlenmiş genleri çıkardık. Şekil 4E ve F, zaman noktası başına önemli ölçüde düzenlenmiş genlerin sayısını gösterir. Tablo 1, sonuçları farklı bir şekilde özetlemektedir. ER stres yanıtı sırasındaki önemli RNA seviyesi düzenlemelerinin çoğu, ara aşamada ve ayrıca geç aşamada meydana geldi (Şekil 4, Tablo 1). Düzenleyici aktivite, yani değişen mRNA hız oranları, daha sonra ilave bir düzenleme olmaksızın 2 ila 8 saatlik işaretin etrafında yükseldi: Konsantrasyonlar yavaşça ilk değerlere geri döndü. Protein seviyesi için de benzer bir genel model gözlendi (Şekil 4).

Tablo 1, düzenlemenin fazına, düzeyine ve yönüne göre gruplandırılmış, kopyalardan biri için önemli düzenleyici olayların sayısını gösterir. Çoğu değişiklik ara aşamada meydana gelse de, bu değişikliklerin dağılımları aşamalar arasında tutarlıdır ve farklı önem sınır değerleri uygulansa (gösterilmemiştir) bile tekrarlanır.Rakamlar tablo boyunca simetrik olarak dağıtılır, bu da Şekil 4E ve F'deki mRNA ve protein seviyesi düzenlemesinin bu deneydeki genel gen ekspresyonu değişikliklerine eşit olarak katkıda bulunduğu ve benzer sayıda gen etkilediği gözlemini doğrular. Tablo 1'de gösterildiği gibi, eğer bir gen, yanıtın belirli bir aşamasında önemli ölçüde düzenlendiyse, bu düzenleme tipik olarak ya mRNA'da ya da protein düzeyinde meydana gelir, ancak her ikisinde de aynı anda değil, karenin her bir köşesindeki genlerin sayısı aynıdır. orta sıralardaki veya sütunlardakilerden daha küçüktür. Bununla birlikte, bazı genler, aynı fazda aynı yönde hareket eden mRNA ve protein seviyesi düzenlemesi gösterdi ve diğerleri, zıt yönlerde hareket gösterdi.

Tablo 1 zaten uyumsuz düzenlemenin nispeten nadir olduğunu göstermektedir: Tabloların sol alt ve sağ üst köşelerinde yalnızca birkaç gen listelenmiştir (toplamda 75 gen). Böyle bir örnek, mRNA ifadesinin aşağı regüle edildiği ve protein ifadesinin 16 saatlik zaman noktasında yukarı regüle edildiği GRP78'dir (Şekil 3). Uyumsuz düzenlemeyi tanımlamanın alternatif bir yolu, bu sonucu doğruladı, yani PECA'nın mRNA'sı ile her iki kopyadaki protein zaman-yol oranı oranları arasındaki negatif korelasyon için filtreleme yoluyla (Veri Kümesi EV1, Ek Şekil S16A ve B). Daha sonra bu filtrelemeyi daha da geliştirdik ve sadece karşıt düzenleme, yani mRNA'da en az bir önemli düzenleyici olay ve protein düzeyinde bir önemli düzenleyici olay değil, aynı zamanda sabit protein konsantrasyonları, yani her iki biyolojikte de 1.5 kattan daha küçük değişiklikler gerekliydi. çoğalır. Böyle bir senaryo, mRNA konsantrasyonlarındaki değişikliklerin, protein düzeyinde genel bir değişiklikle sonuçlanmaması için dengelendiği "tamponlama" durumlarını gösterecektir. 75 genden üçü bu ek filtrelemeyi geçti ve Ek Şekil S16C'de gösterilmektedir. Bu genlerden biri, aşağıda tartışılan bir şaperon olan HSC70'dir (RCM = 0.91/0.09) (Şekil 6A). Genel olarak, uyumsuz düzenlemenin nadir olduğu ve mRNA ile proteinin sentez ve bozunma dengesindeki dinamiklerin bağımsız bir şekilde gerçekleştiği sonucuna varıyoruz.

Protein ekspresyon düzenlemesi yeni bir kararlı duruma ulaşır

Düzenleyici değişikliklerin genel katkılarını ve yönünü belirledikten sonra, genel geçici düzenleme modellerini incelemeye başladık. Bunu yapmak için, medyan merkezli RNA ve protein oran oranlarının kümelenmiş bir ısı haritası oluşturduk ve en büyük altı kümedeki ortalama oran oranlarını hesapladık (Şekil 5). Ardışık sütunlar arasındaki renklendirmede keskin bir kontrast, tek bir genin önemli düzeyde düzenlenmesini gösterir: Sentez ve bozunma oranlarındaki bir değişiklik, zaman aralıkları arasındaki oran oranlarında bir değişiklikle sonuçlanır. Şekil 5, mRNA ve protein düzenleme seviyesi arasındaki çarpıcı farkı göstermektedir. RNA düzeyinde düzenleme için, birçok PECA hız oranı ara faz sırasında yükselir ve hem iki hem de sekiz saatlik sınır zaman noktalarında önemli değişikliklere neden olur. Bu aralıktan önce ve sonra, mRNA sentezi ve bozunma oranları, geç faz sırasında bazı istisnalar dışında nispeten sabitti. Örneğin, birçok hücrenin ilk iki saat içinde apoptoza maruz kalması nedeniyle, erken zaman noktalarında düzenleme yokluğunun beklenmedik olduğunu not ediyoruz, bu süreçlerin 30 dakikadaki ilk ölçümümüzden önce meydana gelmiş olabileceğini düşündürmektedir. RNA seviyesi düzenlemesinin darbe benzeri veya geçici davranışı, hem genişletilmiş veri seti (2.131 gen) hem de tüm transkriptom (> 18.000 gen) için doğrulandı (Ek Şekiller S19 ve S21), bu da yüksek güvenilir veri kümesinin teslim ettiğini gösterir. temsili sonuçlar. 2 ila 8 saat arasındaki aşırı oran oranlarında, bu aşamaya giren ve çıkan önemli düzenlemelerle güçlü artışlar gözlemliyoruz.

Şekil 5. RNA ve protein düzeyindeki düzenlemelerin farklı zamansal modları vardır

  1. İki kopya için gösterilen, PECA tarafından hesaplanan RNA ve protein oranı oranlarının ısı haritası.
  2. Hem RNA (üstte) hem de protein (altta) için altı ana kümedeki ortalama oran oranları. RNA oranı oranları, ara faz sırasındaki değişikliklerinde bir artış gösterirken, protein oranı oranları, iki saatlik işaret civarında yalnızca bir kez değişir ve deneyin geri kalanı boyunca yeni sabit durum seviyesinde kalır. Kümeler, Veri Kümesi EV1'de tanımlanır.

Daha sonra, deneyimiz sırasında protein seviyesi düzenlemesinin zamansal davranışını analiz ettik. MRNA'ya benzer şekilde, erken fazda çok az düzenleme meydana geldi, ancak ara fazda hızla arttı (Şekil 5). Bununla birlikte, RNA seviyesi düzenlemesinin darbe benzeri modunun aksine, PECA, birçok protein oranı oranının ara faz sırasında anahtara benzer veya kalıcı bir şekilde yalnızca bir kez değiştiğini, ancak daha sonra sabit kaldığını gösterdi. Bu anahtara benzer davranış, farklı gen ekspresyon kümeleri arasında ortalama hız oranı değişiklikleri incelenirken daha da belirgindir (Şekil 5, sağ). Yaklaşık 2 saatteki değişiklikten sonra, protein konsantrasyonları geri dönmedi ve deneyin geri kalanı boyunca yeni seviyede kaldı; bu, ek düzenleme olmaksızın daha önce ayarlanmış olan aynı protein sentezi ve bozunma oranlarının gerçekleştirildiğini gösterir. Şekil 5'te (sağda) görülebileceği gibi, hem yukarı hem de aşağı düzenlemeye uygulanan anahtar benzeri davranış mRNA düzenleme modundan bağımsızdı. Genişletilmiş veri setinde de mevcuttur (Ek Şekil S19). PECA sonuçları, konsantrasyon verilerinin neyi işaret ettiğini doğruladı: mRNA ifadesi orijinal değerlere dönerken, protein seviyesi düzenlemesi yeni bir sabit duruma ulaştı.

PECA sonuçları, düzenleyici modlar hakkında hipotezler oluşturmaya yardımcı olur

Son olarak, analizimizin, aksi takdirde gizlenen sinyalleri nasıl tespit edebileceğini ve olası düzenleyici modlar hakkında hipotezler oluşturmaya yardımcı olabileceğini göstermek için üç gen grubunu ayrıntılı olarak inceledik. İlk örnek grup GRP78 (HSPA5, BiP RCM = 0.87/0.97) ve diğer şaperonları içerir (Şekil 6A). Yukarıda tartışıldığı gibi, ER stres yanıtı sırasındaki önemli rolü nedeniyle GRP78'in hem mRNA hem de protein düzeyinde yukarı regülasyonu beklenir. Güçlü protein seviyesi yukarı regülasyonunun, 5′UTR'sindeki dahili ribozom giriş bölgesi tarafından aracılık edilebileceğini varsaymak cazip gelebilir. Ancak, bu hipotezin geçerliliği hala tartışılmaktadır (Fernandez ve diğerleri, 2002 ).

Şekil 6. PECA, benzer şekilde düzenlenmiş gen gruplarını tanımlar

  1. Karışık ifade modellerine sahip GRP78 dahil beş şaperon.
  2. Çoğunlukla değişmez RNA konsantrasyonları ve artan protein konsantrasyonları ile deneyde gözlemlenen sekiz ATP sentaz alt birimi. PECA, gizli sinyali yükseltir ve önemli bir protein seviyesi düzenlemesini tanımlar.
  3. MRNA konsantrasyonu geçici olarak artan, ancak protein konsantrasyonları büyük ölçüde sabit kalan altı aminoasil-tRNA sentetaz. PECA, RNA ve protein seviyelerinde hareket eden iki karşıt düzenleyici etkiyi çözer.

Bu gruptaki diğer bir gen, hücrede hayatta kalma işlevlerine sahip bir şaperon olan GRP78'e benzer olan HSC70'dir (HSPA8 RCM = 0.91/0.09) (Zhang ve diğerleri, 2013 ). Bununla birlikte, protein ekspresyon modeli, zaman süreci boyunca sabit kalması bakımından GRP78'inkinden farklıdır. HSC70 yapısal olarak ifade edilir ve yeni oluşan protein zincirlerinin katlanmasına yardımcı olur. Stres altında hafif indüklendiği açıklanmıştır (Liu ve diğerleri, 2012 ). Veri kümemizde, deneyin erken evresinde mRNA konsantrasyonlarında önemli bir düşüş ve daha sonraki bir iyileşme gözlemliyoruz. İlginç bir şekilde, bu ifade değişikliği protein konsantrasyonlarına iletilmez, ancak protein ifadesinin önemli, geçici bir yukarı regülasyonu ile dengelenir. Bu davranış, HSC70'i yukarıda tartışılan potansiyel tamponlama için üç örnekten biri yapar (Ek Şekil S16).

Sadece HSC70 değil, aynı zamanda HSP90AA1 ve HSP90B1, HSP90 proteinleri için yardımcı şaperonlar olarak hizmet eder. HSP90B1 (GRP94, TRA1 RCM = 0.90/0.91) melanozomlarda ve ER'de lokalizedir ve protein katlanmasına yardımcı olur. Proteinin iki fazda düzenlendiği görülmektedir. Kısa süreli bir transkripsiyon artışından sonra (ardından transkripsiyon düşüşü), ER stres deneyinin orta ve geç fazları sırasında protein üretimi artar. Son olarak, Şekil 6A, Hsp40 şaperon ailesinin bir üyesi ve bir eIF2a kinaz PERK inhibitörü olan P58IPK'yi (DNAJC3 RCM = 0.88/0.63) göstermektedir. Bu işlev nedeniyle, ilk, ER stresi ile ilgili çeviri kapatmasından (Roobol) sonra çevirinin yeniden başlatılması için gereklidir. ve diğerleri, 2015 ). P58IPK'nin promotör bölgesindeki bir ER stres öğesinin, ER stresine yanıt olarak genin transkripsiyonunu aktive ettiği bilinmektedir (Yan ve diğerleri, 2002 ). Deneyimizde, mRNA seviyesindeki yukarı regülasyona rağmen, protein konsantrasyonları tüm zaman süreci boyunca sabittir, bu da protein seviyesinde homeostatik aşağı regülasyon olduğunu düşündürür. Ancak bu vaka, kriterlerimize göre arabelleğe almaya uygun değildi. Düşük P58IPK seviyeleri, GRP78 konsantrasyonundaki sürekli artışla birlikte (Yan ve diğerleri, 2002), deneyimizde devam eden bir ER stres yanıtının normal çeviriye dönüşü geciktirdiğini gösterir.

İkinci örnek grup, değişmez RNA konsantrasyonlarına sahip, ancak protein konsantrasyonları geç fazda artan 196 gen içerir (Ek Şekil S14, Veri Kümesi EV1, küme 8). Bu gruptaki genler mitokondriyal proteinler, ATP biyosentezi, ribozomlar, translasyon ve transmembran proteinleri bakımından zengindir (FDR < 0.05). ATP sentaz genleri Şekil 6B'de gösterilmektedir. ATP sentazlarının hücresel ATP biyosentezinde önemli rolleri vardır ve artan aktiviteleri muhtemelen hücresel ATP seviyelerini yükseltir ve bu da UPR için gereken enerjinin sağlanmasına yardımcı olur. Benzer ifade modellerine sahip sekiz alt birim (ATP5B, C1, D, F1, H, I, L, O ortalama RCM = 0.50/0.61) belirledik. Bu genlerin PECA'sı, aracımızın başka türlü gizli bir sinyali nasıl çıkarabileceğini gösterir: PECA, protein düzeyinde ATP sentaz alt birimlerinin mutlak protein konsantrasyonlarında bir artışla sonuçlanan önemli bir pozitif düzenlemeyi doğru bir şekilde tanımladı.

Bu proteinlerin yukarı regülasyonu için olası mekanizmalar hakkında hipotezler oluşturmak için uzunluk, sinyal dizileri, nükleotid bileşimi, amino asit bileşimi, çeviri düzenleyici elemanlar, RNA ikincil yapıları ve çeviri sonrası modifikasyonlar dahil olmak üzere 160 dizi özelliği topladık (Ek Tablo S2). Bu örnek grubu, özellikler arasındaki önyargılar için test ederken, protein yarı ömürlerini kısaltan PEST dizilerinin parçaları olan prolin ve glutamik asitte ve düzensiz bölgelerde, yani COILS ve REM465'te önemli bir azalma bulduk (T-Ölçek, P < 0.0001), proteinleri destabilize ettiği bilinmektedir. Bu iki özelliğin tükenmesi, proteini stabilize edecek ve PECA tarafından bulunan yukarı regüle edilmiş protein ekspresyonunu açıklayacaktır.

Son örnek grup, hem mRNA hem de protein konsantrasyonlarında bir artış ile karakterize edilen ve oksidoredüktazlarda ve ilginç bir şekilde aminoasil-tRNA sentetazlarında önemli ölçüde zenginleştirilmiş 91 gen (Veri Kümesi EV1, küme 3) içerir, yani GARS, YARS, IARS, AARS, SARS , ve EPRS (FDR <0.05 ortalama RCM = 0.88/0.21). Aminoasil-tRNA sentetazları Şekil 6C'de gösterilir ve Ek Şekiller S17 ve S18'de daha detaylı olarak incelenir. Bir dizi enzim, RNA sentezine kıyasla, protein sentezinin birkaç saat geciktiği çarpıcı bir gen ekspresyon paterni gösterir. Bu protein sentezi sadece mRNA konsantrasyonları zaten düştükten sonra gerçekleştiğinden, nihai protein konsantrasyonları nispeten sabit kalır (Şekil 6C). Bu vakalar, filtreleme kriterlerimizi geçmedikleri için “tamponlama” düzenlemesi için uygun değildi.

Bununla birlikte, aminoasil-tRNA sentetazlarının transkripsiyon sonrası düzenlemesi daha önce başka bağlamlarda gözlemlenmiştir (Kwon ve diğerleri, 2011 Chen ve diğerleri, 2012 Parkı ve diğerleri, 2012 Guan ve diğerleri, 2014 Wei ve diğerleri, 2014 ). Hücresel rolü ve altta yatan mekanizma, yakın tarihli bir yayın ilgi çekici bir açıklama getirene kadar bilinmiyordu: Aminoasil-tRNA sentetazları, katalitik alandan yoksun, ancak çeviri sırasında orijinal rollerinden bağımsız olarak genellikle ek "ay ışığı" işlevlerine sahip olan alternatif ek varyantlarını ifade eder (Lo ve diğerleri, 2014 ). Bu bulgulara dayanarak, bazı genler için mRNA ve protein ekspresyon paternleri arasındaki uyuşmazlığın, splice varyantlarının diferansiyel ekspresyonu ile açıklanabileceğini varsaydık ve bu tür örnekler için proteomik verilerini manuel olarak inceledik (Ek Şekiller S17 ve S18). Ne yazık ki, proteomik deneyi ek varyantlarını tespit etmek için tasarlanmadığından, sadece üç enzim (AARS, IARS ve QARS) bazı sonuçlara varmak için yeterli bilgi sağladı. Bu üç enzimin her biri için diferansiyel ekspresyona sahip bir dizi dizi varyantı saptasak da, gelecekteki çalışmalar, bu alternatif ekleme olaylarının gerçekten işlevsel olup olmadığını ve Şekil 6C'de gözlemlendiği gibi genel, ortalama protein ekspresyon seviyelerini etkileyip etkilemediğini doğrulamak zorunda kalacak.


Hücre Döngüsünün Kontrolü

Hücre döngüsünün uzunluğu, tek bir organizmanın hücreleri içinde bile oldukça değişkendir. İnsanlarda hücre dönüşüm sıklığı, erken embriyonik gelişimde birkaç saatten epitelyal hücreler için ortalama iki ila beş güne veya G'de geçirilen tüm bir insan ömrüne kadar değişir. 0 kortikal nöronlar veya kalp kası hücreleri gibi özel hücreler tarafından. Bir hücrenin hücre döngüsünün her aşamasında harcadığı zamanda da farklılıklar vardır. Hızlı bölünen memeli hücreleri kültürde (optimum büyüme koşulları altında vücut dışında) büyütüldüğünde, döngünün uzunluğu yaklaşık 24 saattir. Hücre döngüsündeki olayların zamanlaması, hücrenin hem içindeki hem de dışındaki mekanizmalar tarafından kontrol edilir.


Ferritinin hormonlar, büyüme faktörleri ve ikinci haberciler tarafından düzenlenmesi

İnsan ferritin H geninin transkripsiyonu, hem hormonlara hem de cAMP dahil olmak üzere ikinci habercilere yanıt olarak indüklenir. NScisBu tepkilere aracılık eden etkili elementler, insan ferritin H geninin proksimal promotöründe nispeten küçük bir bölgeye eşlenmiştir (Şekil 2).

Ferritin H'yi kemirgen hücrelerinde tirotropine yanıt olarak farklı şekilde eksprese edilen bir gen olarak tanımlayan 2 grup vardı.100,101 Sonraki çalışma, dibutiril-cAMP'nin, farklı kinetiklerle de olsa, tirotropinin ferritin H transkriptleri üzerindeki etkisini özetlediğini ortaya çıkardı.102 Sıçan kısa fragmanları 5′ yan bölge (400 bp'ye kadar) ancak daha uzun olmayan fragmanlar, murin 3T3 hücrelerinde ve FRTL5 tiroid hücrelerinde dibutiril-cAMP ve tirotropine yanıt veriyordu.103,104 Nükleer sürekli denemeler, tirotropinin ferritin H.105 üzerindeki transkripsiyonel etkisini doğruladı. -bağımlı ferritin indüksiyonu tarafından inhibe edildi ras sıçan tiroid hücre hattında.106

Toplu olarak, bu deneyler, tirotropinin, muhtemelen cAMP'yi yükselterek, ferritin H transkripsiyonunu arttırdığını gösterdi. Ferritin H transkripsiyonunun cAMP aracılı indüksiyonu ayrıca insan HeLa hücrelerinde tanımlanmıştır.107 İnsan cAMP'ye yanıt veren bölge (B kutusu), transkripsiyon faktörü NFY'den oluşan B-box bağlama faktörleri (Bbf) olarak adlandırılan bir protein kompleksine bağlanır, koaktivatör p300 ve histon asetilaz p300/CBP ilişkili faktör (PCAF).108,109 Adenoviral onkogen E1A bu kompleksin oluşumunu azaltır. p300'ün HeLa hücrelerinde aşırı ekspresyonu, Bbf.110 tarafından tahrik edilen ferritin promotörünün E1A aracılı inhibisyonunu tersine çevirir. Bir fosfataz inhibitörü olan okadaik asit, p300 koaktivatör molekülü ve Bbf'nin diğer bileşenleri arasındaki etkileşimi artırarak HeLa hücrelerinde H ferritin transkripsiyonunu uyarır. 111 Düşük insan ferritin H ekspresyonuna sahip hücrelerde, histon asetilaz PCAF'nin aşırı ekspresyonu, ferritin H'nin B-kutusundan transkripsiyonu aktive eder.112 B-box, Caco- 2 kolon karsinom hücresi108 ve vasküler düz kas.113 İnsan ferritin H genindeki diğer önemli düzenleyici unsurlar, bir SP-1 konsensüs sekansı içeren, -132 konumunda A-kutusu olarak adlandırılan bir bölgeyi içerir.114

Kemirgen cAMP düzenleyici bölgesinin değerlendirilmesi, daha uzun promotör fragmanlarının tirotropine karşı geliştirilmiş tepkiden ziyade azalmış bir tepki sergilediğini gösterdiğinden, bu deneyler ayrıca negatiflerin varlığını da ortaya koydu. ciscAMP ve tirotropinin etkisini ortadan kaldırabilecek etkili elementler. Ferritin H transkripsiyonunun negatif düzenleyici(ler)i için ek kanıt Barresi ve ark.115 tarafından elde edilmiştir. ferritin H geni. Bu bölgedeki bir 3-bp ikame mutasyonu, HeLa hücrelerinde promotör aktivitesini arttırdı ve bu dizinin ferritin transkripsiyonu üzerinde inhibe edici bir etkisi olduğunu ortaya koydu. G açısından zengin dizilere her yerde bağlanan inhibitör faktör 1'in (IF-1) bu bölgeye bağlanması önerildi.

Tiroid hormonu ayrıca ferritini transkripsiyon sonrası olarak da düzenleyebilir: T3, muhtemelen IRP1.116'nın fosforilasyonuyla sonuçlanan sinyal iletim basamaklarının indüklenmesi yoluyla, IRP1'in ferritin IRE'ye bağlanma yeteneğini etkileyen IRP1'in aktivitesini modüle eder ve TRH ayrıca IRP2'nin fosforilasyonunu indükler. 51

Murin ve insan ferritin H geni arasındaki benzerlikler, yalnızca ferritin fonksiyonunun korunmasını değil, türler arasında ferritin düzenlemesinin de korunmasını vurgular. Murin ferritin H geni, yukarıda açıklananlara benzer elementler içerir, ancak bunlar, insan ferritin H geninde tanımlanan ilgili düzenleyici elementlere neredeyse 5 kb 5' yer alır (bkz. Şekil 2). Murin ferritin H geni, aynı zamanda p300'e bağlanan ve E1A tarafından inhibe edilen bir bazal güçlendirici FER1 içerir. Ancak bugüne kadar FER1 bölgesinin cAMP'ye yanıt verdiği gösterilmemiştir.

Tiroid hormonuna ek olarak, insülin ve IGF-1 de mRNA düzeyinde ferritinin düzenlenmesinde rol oynar. İnsülin ve IGF-1'in her ikisi de C6 glioma hücrelerinde H ve L ferritin için mRNA'yı indükledi.118 Her iki hormon da her birinin optimal konsantrasyonunda bir araya getirildiğinde ferritin indüksiyonu üzerinde ilave bir etki yoktu, bu da insülinin IGF-1 aracılığıyla etki edebileceğini düşündürdü. reseptör.118 İnsülin ve IGF-1 tarafından ferritin H ve L'nin eşit indüksiyonunun aksine, pankreas hücrelerinde yüksek glukoz, ferritin H mRNA'sında 4 ila 8 kat artışla, ferritin H mRNA'nın seçici indüksiyonuna neden oldu. Ferritin L'de %75 ila %90 azalma ve immün boyama ile test edildiği gibi ferritinde genel 3 kat artış.119


Referanslar

Elowitz M, Levine A, Siggia E, Swain P: Tek bir hücrede stokastik gen ekspresyonu. Bilim. 2002, 297: 1129-1131. 10.1126/bilim.1070919

Bar-Even A, Paulsson J, Maheshri N, Carmi M, O'Shea E, Pilpel Y, Barkai N: Protein ifadesinde gürültü, doğal protein bolluğu ile ölçeklenir. Doğa Genetiği. 2006, 38: 536-643.10.1038/ng1807.

Cai L, Friedman N, Xie X: Tek molekül seviyesinde tek tek hücrelerde stokastik protein ifadesi. Doğa. 2006, 440: 358-362. 10.1038/doğa04599

Dublanche Y, Michalodimitrakis K, Kümmerer N, Foglierini M, Serrano L: Noise in transkripsiyon negatif geri besleme döngüleri: simülasyon ve deneysel analiz. Mol Sys Biol. 2006, msb4100081: E1-

Hooshangi S, Weiss R. Negatif geri beslemenin transkripsiyonel gen ağlarında gürültü yayılımı üzerindeki etkisi. KAOS. 2006, 16: 026108- 10.1063/1.2208927

Kepler T, Elston T. Transkripsiyonel düzenlemede stokastiklik: kökenler, sonuçlar ve matematiksel temsiller. Biyofizik Dergisi. 2001, 81: 3116-3136.

Thattai M, van Oudenaarden A. Gen düzenleyici ağlarda içsel gürültü. Proc Natl Acad Sci ABD. 2001, 98: 8614-8619. 10.1073/pnas.151588598

Swain P, Elowitz M, Siggia E: Gen ifadesinde stokastikliğe içsel ve dışsal katkılar. Proc Natl Acad Sci ABD. 2002, 99: 12795-12800. 10.1073/pnas.162041399

Paulsson J: Gen ağlarındaki gürültüyü özetlemek. Doğa. 2004, 427: 415-418. 10.1038/nature02257

Keseler I, Collado-Vides J, Gama-Castro S, Ingraham J, Paley S, Paulsen I, Peralta-Gil M, Karp P: EcoCyc: Eschercichia coli için kapsamlı bir veritabanı kaynağı. Nükleik Asitler Araş. 2005, 33: D334-337. 10.1093/nar/gki108

Becskei A, Serrano L. Otoregülasyon ile gen ağlarında mühendislik kararlılığı. Doğa. 2000, 405: 590-593. 10.1038/35014651

Wall M, Hlavacek W, Savageau M: Bastırılabilir bir gen devresinde regülatör gen ekspresyonu için tasarım ilkeleri. J Mol Biol. 2003, 332: 861-876. 10.1016/S0022-2836(03)00948-3

Shinar G, Dekel E, Tlusty T, Alon U: Hata minimizasyonuna dayalı biyolojik düzenleme kuralları. Proc Natl Acad Sci ABD. 2006, 103: 3999-4004. 10.1073/pnas.0506610103

Simpson M, Cox C, Sayler G: Otoregüle edilmiş gen devrelerinde gürültünün frekans alanı analizi. Proc Natl Acad Sci ABD. 2003, 100: 4551-4556. 10.1073/pnas.0736140100

Austin D, Allen M, McCollum J, Dar R, Wilgus J, Sayler G, Samatova N, Cox C, Simpson M: Doğal gürültü spektrumunun gen ağı şekillendirme. Doğa. 2006, 439: 608-611. 10.1038/nature04194

Cox C, McCollum J, Austin D, Allen M, Dar R, Simpson M: Basit gen devrelerinde gürültünün frekans alanı analizi. KAOS. 2006, 16: 026102- 10.1063/1.2204354

Rosenfeld N, Elowitz M, Alon U: Negatif otoregülasyon, transkripsiyon ağlarının yanıt sürelerini hızlandırır. J Mol Biol. 2002, 323: 785-793. 10.1016/S0022-2836(02)00994-4

Kierzek A, Zaim L, Zielenkiewicz P: Transkripsiyon ve translasyon başlatma frekanslarının prokaryotik gen ekspresyonundaki stokastik dalgalanmalar üzerindeki etkisi. J Biol Chem. 2001, 276: 8165-8172. 10.1074/jbc.M006264200

Chivers P, Sauer R: Bakterilerde yüksek afiniteli nikel alımının düzenlenmesi. Biyolojik Kimya Dergisi. 2000, 275: 19735-19741. 10.1074/jbc.M002232200

Rolfes R, Zalkin H: Escherichia coli purR'nin otoregülasyonu, promotörün akış aşağısında iki kontrol bölgesi gerektirir. J Bakteriyol. 1990, 172: 5758-5766.

Plumbridge J, Pellegrini O: Escherichia coli'nin chitobiose operonunun ifadesi, üç transkripsiyon faktörü tarafından düzenlenir: NagC, ChbR ve CAP. Mol Mikrobiyol. 2004, 52: 437-449. 10.1111/j.1365-2958.2004.03986.x

Kostelidou K, Thomas C. KorB'nin geniş konakçı menzilli plazmit RK2 üzerindeki 12 bağlanma yerindeki hiyerarşisi ve bu bağlanmanın IncC1 proteini tarafından modülasyonu. J Mol Biol. 2000, 295: 411-422. 10.1006/jmbi.1999.3359

Wang Q, Wu J, Friedberg D, Platko J, Calvo J: Escherichia coli lrp geninin düzenlenmesi. J Bakteriyol. 1994, 176: 1831-1839.

Özdubak E, Thattai M, Kurster I, Grossman An, van Oudenaarden A: Tek bir genin ifadesinde gürültünün düzenlenmesi. Doğa Genetiği. 2002, 31: 69-73. 10.1038/ng869

Koern M, Elston T, Blake W, Collins J: Gen ifadesinde stokastiklik: teorilerden fenotiplere. Doğa İncelemeleri Genetik. 2005, 6: 451-464. 10.1038/nrg1615

Samoilov M, Arkin A. Moleküler reaksiyon yollarında sapkın etkiler. Doğa Biyoteknolojisi. 2006, 24: 1235-1240. 10.1038/nbt1253.

Reichheld S, Davidson A. Tetrasiklin baskılayıcıda iki yönlü alanlar arası sinyal iletimi. J Mol Biol. 2006, 361: 382-389. 10.1016/j.jmb.2006.06.035

Simpson M, Cox C, Sayler G: Gen transkripsiyon düzenlemesinde stokastikliğin frekans alanı kimyasal Langevin analizi. J Theor Biol. 2004, 229: 383-394. 10.1016/j.jtbi.2004.04.017

Bingle L, Thomas C. Plazmitin hayatta kalması için düzenleyici devreler. Mikrobiyolojide Güncel Görüş. 2001, 4: 194-200. 10.1016/S1369-5274(00)00188-0

de la Hoz A, Ayora S, Sitkiewicz I, Fernandez S, Pankiewicz R, Alonso J, Ceglowski P: pSM19035'in plazmid kopya sayısı kontrolü ve rastgeleden daha iyi ayırma genleri ortak bir düzenleyiciyi paylaşır. Proc Natl Acad Sci ABD. 2000, 97: 728-733. 10.1073/pnas.97.2.728

El-Samad H, Kurata H, Doyle J, Gross C, Khammash M: Isı şokundan kurtulmak: sağlamlık ve performans için kontrol stratejileri. Proc Natl Acad Sci ABD. 2005, 102: 2736-2741. 10.1073/pnas.0403510102

Neidhardt F, Ingraham J, Schaechter M: Bakteriyel Hücrenin Fizyolojisi: Moleküler Bir Yaklaşım. 1990, Sunderland, Massachusetts: Sinauer

Keeling M: Ekolojide çarpımsal anlar ve kalıcılık ölçüleri. J Theor Biol. 2000, 205: 269-281. 10.1006/jtbi.2000.2066

Gibson M, Bruck J: Birçok tür ve çok kanallı kimyasal sistemlerin verimli tam stokastik simülasyonu. J Phys Chem A. 2000, 104: 1876-1889. 10.1021/jp993732q.


ZH ve SG: kavramsallaştırma. ZH, ML, UK ve SG: metodoloji. ZH, ML, UK, CP ve SG: doğrulama. ZH, ML ve SG: resmi analiz ve yazının orijinal taslak hazırlığı. SG, CP ve SH-C: kaynaklar. ZH, ML, SG, CP ve SH-C: yazı inceleme ve düzenleme. SG: denetim ve proje yönetimi. SG, ZH, CP ve ML: fon alımı. Tüm yazarlar, makalenin yayınlanan versiyonunu okudu ve kabul etti.

Bu çalışma kısmen Stiftung krebskranke Kinder'sx2014Regio basiliensis, Stiftung pro UKBB, Basel Üniversitesi ve Çin Burs Konseyi (CSC, 201706920049) tarafından verilen araştırma hibeleriyle desteklenmiştir. CP ve ML, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı'na mali destek için teşekkür etti.


Bilim adamları, hücrelerin genlerini ritmik olarak düzenlediğini buldu

Flüoresan protein kaynaşmış Msn2 (yeşil) ve Mig1 (kırmızı) ifade eden tomurcuklanan maya hücrelerinin statik bir resmi gösterilmektedir. Her bir yeşil veya kırmızı sinyal noktası, karşılık gelen proteinin nükleer lokalizasyonunu temsil eder. Sarı renk, iki proteinin birlikte lokalizasyonunu temsil eder. Kredi: Michael Elowitz ve Yihan Lin/Caltech

Sakin, değişmeyen bir ortamda bile hücreler statik değildir. Diğer eylemlerin yanı sıra hücreler, bir dizi öngörülemeyen ve aralıklı darbede bazı transkripsiyon faktörlerini (genlerin ekspresyonunu kontrol eden proteinler) etkinleştirir ve ardından devre dışı bırakır. Bu titreşimli fenomeni keşfettiğinden beri, bilim adamları hücreler için hangi işlevleri sağlayabileceğini merak ettiler.

Şimdi, Caltech araştırmacılarından yeni bir çalışma, darbenin iki proteinin genleri kontrol etmelerine izin veren ritmik bir şekilde birbirleriyle etkileşime girmesine izin verebileceğini gösteriyor. Spesifik olarak, transkripsiyon faktörlerinin ifadesi senkronizasyona girip çıktığında, gen ifadesi de yukarı ve aşağı gider. Araştırmacılar, bu aktivasyon ritimlerinin, yaşam krallıklarındaki organizmaların hücrelerindeki temel süreçlerin altında da yatabileceğini söylüyor.

Biyoloji ve biyoloji mühendisliği profesörü Michael Elowitz, "Transkripsiyon faktörü darbelerinin zamanla birbirleriyle senkronize olma şekli, hücrelerin bilgiyi işlemesine, diğer hücrelerle iletişim kurmasına ve strese tepki vermesine izin vermede önemli bir rol oynayabilir" diyor. Howard Hughes Tıp Enstitüsü'nden bir araştırmacı.

Caltech doktora sonrası araştırmacısı Yihan Lin tarafından yönetilen araştırma, 15 Ekim sayısında yayınlandı. Doğa. Makalenin diğer Caltech yazarları, Cai laboratuvarında bir personel bilimcisi olan Kimya Yardımcı Doçent Long Cai Chang Ho Sohn ve Elowitz'in eski yüksek lisans öğrencisi Chiraj K. Dalal (PhD '10), şimdi UC San Francisco'da.

Cai, Dalal ve Elowitz, 2008'de transkripsiyon faktörünün titreşmesi için işlevsel bir rol bildirdiler. Bu arada, dünya çapındaki araştırmacılar, çeşitli hücre tipleri ve genetik sistemler arasında benzer protein aktivitesi dalgalanmalarını istikrarlı bir şekilde ortaya çıkardılar.

Değişmeyen koşullarda bile aynı hücrede birçok farklı faktörün titreştiğini fark eden Caltech bilim adamları, hücrelerin bu atımların göreli zamanlamasını yeni bir tür zamana dayalı düzenleme sağlamak için ayarlayıp ayarlayamayacağını merak etmeye başladılar. Bunu bulmak için, bireysel maya hücrelerinde gerçek zamanlı olarak iki titreşimli proteini ve bir hedef geni takip etmek için hızlandırılmış filmler kurdular.

Ekip, Msn2 ve Mig1 adlı iki merkezi transkripsiyon faktörünü sırasıyla yeşil ve kırmızı floresan proteinlerle etiketledi. Transkripsiyon faktörleri aktive edildiğinde, gen ekspresyonunu etkiledikleri çekirdeğe doğru hareket ederler. Faktörlerin aktivasyonu kadar bu hareket de görselleştirilebilir, çünkü flüoresan belirteçler çekirdeğin küçük hacmi içinde yoğunlaşarak çekirdeğin yeşil, kırmızı veya her ikisi de parlak bir şekilde parlamasına neden olur. Floresan etiketler için renk seçimi sembolikti: Msn2 bir aktivatör ve Mig1 bir baskılayıcı olarak hizmet ediyor. Elowitz, "Yeşil faktör Msn2 gaza basıyor ve gen ifadesini tetikliyor, kırmızı faktör Mig1 ise frene basıyor" diyor.

Bilim adamları, örneğin ısı ekleyerek veya yiyecekleri kısıtlayarak maya hücrelerini vurguladıklarında, Msn2 ve Mig1 darbeleri, stres uyaranına bağlı olarak, darbeleri arasında az ya da çok örtüşme periyotları ile birbirlerine göre zamanlamasını değiştirdi. .

Genel olarak, iki transkripsiyon faktörü eşzamanlı olarak darbeli olduğunda, baskılayıcı, aktivatörün genleri açma yeteneğini bloke etti. Elowitz, "Birinin bir arabadaki gaz ve fren pedallarını aynı anda tekrar tekrar pompalaması gibi" diyor.

Ancak, aktivatör, baskılayıcı olmadan titreştiğinde, yenilmez olduklarında, gen ekspresyonu arttı. Elowitz, "Hücre, fren ve gaz arasında geçiş yaptığında (bu durumda Msn2 transkripsiyon faktörü) araba hareket edebilir" diyor. Bu stresin değiştirdiği ritimlerin bir sonucu olarak, hücreler, mayanın hoş olmayan durumla başa çıkmasına yardımcı olan belirli proteinlerin daha fazla (veya daha az) kopyasını başarıyla üretti.

Daha önce, araştırmacılar, çekirdekteki çoklu transkripsiyon faktörlerinin nispi konsantrasyonlarının, ortak bir gen hedefini nasıl düzenlediklerini belirlediğini düşünmüşlerdi - birleşimsel düzenleme olarak bilinen bir fenomen. Ancak yeni çalışma, transkripsiyon faktörlerinin atımlarının göreceli zamanlamasının, konsantrasyonları kadar önemli olabileceğini öne sürüyor.

Cai, "Hücredeki çoğu gen, karmaşık bir ağın parçaları olarak kombinatoryal bir tarzda birkaç transkripsiyon faktörü tarafından düzenlenir" diyor. "Şu anda gördüğümüz şey, transkripsiyon faktörlerinin darbe zamanlamasını kontrol eden yeni bir düzenleme modudur ve bu, genetik ağlardaki kombinatoryal düzenlemeyi anlamak için kritik olabilir."

Lin, "Hücrede, yalnızca tek tek hücrelerin filmleriyle gözlemlenebildiği için, hala büyük ölçüde keşfedilmemiş olan, zamana dayalı bir düzenleme katmanı var gibi görünüyor" diyor. "Bu ilgi çekici ve yeterince takdir edilmeyen gen düzenleme biçimi hakkında daha fazla bilgi edinmek için sabırsızlanıyoruz."

Gelecekteki araştırmalarda, bilim adamları bu yeni keşfedilen zamana dayalı düzenleme modunun çeşitli hücre tiplerinde ne kadar yaygın olduğunu anlamaya çalışacak ve gen düzenleme sistemlerine katılımını inceleyecekler. Sentetik biyoloji bağlamında - biyolojik sistemlerin insan teknolojik uygulamaları için kullanılması ve değiştirilmesi - araştırmacılar ayrıca yeni hücresel davranışları programlamak için bu tür darbeleri kontrol etmek için yöntemler geliştirmeyi umuyorlar.


Bir proteinin yukarı regülasyonunun diğerinin aşırı ekspresyonuna yol açıp açmadığı nasıl belirlenir? - Biyoloji

Bu makale, 30.000'den fazla yayından alınan protein ekspresyonu bilgisine sahip PDB veritabanına ve rastgele seçilmiş yayınların bir Labome anketine dayalı olarak, protein ekspresyonu için yaygın olarak kullanılan vektör-host sistemlerinin bir incelemesini sunar. Toksik proteinlerin ekspresyonu detaylı olarak tartışılmış ve farmasötiklerin üretiminde kullanılan ekspresyon sistemleri kısaca özetlenmiştir.

Şekil 1, iki tipik protein ekspresyonu iş akışını gösterir. Bir iş akışı, saflaştırılmış bir proteinin üretilmesine yol açar. Diğeri, bir rekombinant proteini eksprese eden bir hücre çizgisinin üretilmesine yol açar. Gerçek hayatta, örneğin bir rekombinant proteini saflaştırmak için kaynak materyal olarak stabil bir memeli hücre hattı kullanılacaksa, bu iki iş akışı örtüşebilir.

Yaygın olarak kullanılan bir dizi rekombinant ekspresyon sisteminin avantajları, dezavantajları ve potansiyel uygulamaları Tablo 1'de listelenmiştir. Bir dizi yayın bu sistemler hakkında ayrıntılı bilgi sağlar: Escherichia coli [1-6] Saccharomyces cerevisiae [4, 7-10] Pichia pastoris [5, 8, 9, 11, 12] bakulovirüs / böcek hücreleri [1, 5, 13, 14] memeli hücre hatları [5, 15] ve hücresiz / in vitro protein üretim sistemleri [16]. Tablo 1, bu ifade sistemlerinin temel özelliklerini özetlemektedir. Araştırmacılar bu temel özellikleri geliştirmek için aktif olarak çalışıyorlar (bir inceleme için [17]'ye bakınız). Kodon yanlılığı (Rossetta 2 [18], CodonPlus ril/rp), verimsiz disülfid bağı oluşumu (SHuffle, Origami [19, 20]) ve zayıf membran ekspresyonu sorunlarının üstesinden gelmeyi amaçlayan birkaç E. coli suşu artık ticari olarak mevcuttur. proteinler (C41 ve C43). Benzer şekilde, SUMO, maltoz bağlayıcı protein [21] ve tioredoksin [21] gibi çözünür ifadeyi teşvik etmek üzere tasarlanmış etiketleri kullanan E. coli ifade vektörleri ticari olarak mevcuttur. Sülfhidril oksidazın ön-ekspresyonu, disülfid bağı oluşumunu belirgin şekilde destekleyebilir [22]. Bu yaklaşımlar bazı proteinler için çok iyi çalışır, ancak diğerleri için E. coli'de çözünür, fonksiyonel rekombinant ekspresyon elde etmek hala mümkün değildir [20, 23]. Bakterilerde eksprese edilen proteinler, in vivo kullanılmadan önce örneğin GeneScript [24]'ten Toxineraser endotoksin çıkarma kiti ile çıkarılabilen endotoksinlerle kontamine olur. E. coli suşları, verimliliği düşük olsa da [17, 25] veya His etiketli protein ekspresyonu (LOBSTR suşu) için optimize edilmiş olsa da [26, 27] protein N-glikosilasyonu gerçekleştirmek üzere tasarlanmıştır. Benzer şekilde, bakulovirüs/böcek hücre sisteminde daha fazla memeli benzeri glikosilasyona sahip proteinleri eksprese etmek ve dolayısıyla kullanımını genişletmek için yaklaşımlar geliştirilmektedir [28]. Daha fazla protein salgılanmasını destekleyen bakulovirüs varyantları da geliştirilmektedir [17]. Staus DP ve arkadaşları, BL21/DE3 bakterilerinde ekspresyonunu ve stabilitesini artırmak için, kesilmiş bir sıçan beta-tutuklama 1 genindeki sistein kalıntılarının sayısını en aza indirdi [29].

Araştırmacının karşılaştığı kritik sorun, belirli bir protein ve belirli bir son kullanım için hangi ekspresyon sisteminin en iyi şekilde çalışacağını tahmin etmenin hala mümkün olmamasıdır. Evrensel olarak uygulanabilir bir ifade sistemi henüz mevcut değildir [30]. Bir ifade sistemi seçerken, araştırmacı her sistemin temel özelliklerini, artılarını ve eksilerini ve bu sistemin belirli sınırlamalarının nasıl üstesinden gelinebileceğini akılda tutmalıdır. Kararlar, protein ekspresyonu hedefi/aile üyeleri ve rekombinant proteinin nihai kullanımı bilgisi ile bilgilendirilmelidir. Kaynaklar izin veriyorsa, iki (veya daha fazla) ifade sistemini paralel olarak araştırmak ihtiyatlı olabilir.

ifade sistemi Avantajlar Dezavantajları Uygulamalar Tedarikçiler
Escherichia koli Potansiyel olarak çok yüksek ifade seviyeleri
Düşük maliyetli
Basit kültür koşulları
Hızlı büyüme
ölçeklenebilir
Basit dönüşüm protokolleri
İfadeyi optimize etmek için birçok parametre değiştirilebilir
Yetersiz disülfid bağı oluşumu
Sitoplazmada proteinlerin zayıf katlanması (bakteri proteinleri dahil)
İnklüzyon vücut oluşumu
In vitro yeniden katlama protokolleri verimsiz – avantajları ortadan kaldırabilir
Ökaryotlardan farklı kodon kullanımı
Minimum çeviri sonrası değişiklikler
endotoksin
Büyük proteinleri ifade edemeyebilir
* tasarlanmış suşlar disülfid bağı oluşumu (Shuffle ve Origami), kodon yanlılığı (Rosetta ve CodonPlus ril/rp) veya protein salgılanması ile ilgili sorunları hafifletmeye yardımcı olabilir [31]
Saflaştırılmış protein (yapı, enzimoloji, ilaç keşfi)
Protein terapötikleri
Invitrogen / Yaşam Teknolojileri
EMD Millipore
New England Biolabs
Promega
klon teknolojisi
Avidler
Saccharomyces cerevisiae İyi ifade seviyeleri
Salgılanmış veya hücresel ifade seçimi
Düşük maliyetli
Basit kültür koşulları
ölçeklenebilir
Ökaryotik çeviri sonrası değişikliklerin çoğunu gerçekleştirebilir
Verimli protein katlanması
endotoksin içermez
Muhtemelen Pichia pastoris'ten daha düşük ifade
Sekresyon muhtemelen Pichia pastoris'ten daha düşük
Glikosilasyon hala memeli hücrelerinden farklı
Proteinleri hiperglikosilleştirme eğilimi
Alerjik olarak kabul edilen N-glikan yapıları
Saflaştırılmış protein (yapı, enzimoloji, ilaç keşfi)
Protein terapötikleri
Invitrogen/Yaşam Teknolojileri
Pichia pastorisi Yüksek ifade seviyeleri
Düşük maliyetli
Basit kültür koşulları
Nispeten hızlı büyüme
ölçeklenebilir
Salgılanmış veya hücre içi ekspresyon seçimi
Protein salgısı verimlidir ve basit saflaştırma sağlar
Proteinlerin kapsamlı translasyon sonrası modifikasyonu
Verimli protein katlanması
N-glikosilasyon, Saccharomyces cerevisiae'den daha yüksek ökaryotlara benzer
endotoksin içermez
İndükleyici olarak metanol kullanımı, ölçekte bir güvenlik (yangın) tehlikesidir
Glikosilasyon hala memeli hücrelerinden farklı
Saflaştırılmış protein (yapı, enzimoloji, ilaç keşfi) Invitrogen/Yaşam Teknolojileri
Bakulovirüs bulaşmış böcek hücreleri İyi ifade seviyeleri (özellikle hücre içi proteinler için)
Nispeten hızlı büyüme
Verimli protein katlanması
Orta derecede ölçeklenebilir
Proteinlerin kapsamlı translasyon sonrası modifikasyonu
Glikosilasyon daha çok memeli hücrelerine benzer

İlginç bir şekilde, bir yapısal genomik çabası, Japonya'daki RIKEN Structural Genomics Initiative, yapı belirleme çabaları için proteinler üretmek üzere hücresiz (in vitro transkripsiyon/çeviri) kullanımına odaklanmıştır [3, 36], bu da sentetik kapasiteyi gösterir. modern hücre içermeyen protein ekspresyon sistemlerinin Bununla birlikte, hücresiz sistemler, uygun katlama için düşük verimliliğe sahip olma eğilimindedir.

Yapısal biyoloji için protein ekspresyonunun temel yönleri yakın zamanda 2013'te Current Opinion in Structural Biology'nin özel bir baskısında gözden geçirilmiştir.

Bu makale, en sık kullanılan ifade vektör-konak sistemlerine odaklanmıştır. Bunlar, bir rekombinant proteini ifade etmeyi planlarken ilk başvuru noktası olması muhtemel sistemlerdir. Bununla birlikte, daha birçok başka, daha ezoterik ifade sisteminin mevcut olduğu belirtilmelidir.Bunlar, protein ekspresyonu deneyimi olan araştırmacıların veya daha “ana akım” ekspresyon sistemlerinin belirli bir çalışmanın ihtiyaçlarını karşılamadığı durumlarda ilgi çekici olabilir. Örnek olarak, aşağıdaki mikrobiyal/bitki hücre konak sistemleri tarif edilmiştir: maya (Hansenula polymorpha, Arxula adeninivorans, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Schizosaccharomyces pombe [8]) bakteriler (Bacillus brevis, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis ve CR [2], Corynebacterium [37], hipertermofilik sulfolobus islandicus [38] ) ve algler [39]. Yapısal biyoloji için kullanılan alternatif/daha az yaygın ifade sistemlerinin yakın tarihli bir incelemesi için bkz. [40]. Patojenik olmayan Mycobacterium smegmatis, patojenik Mycobacterium tuberculosis'ten proteinlerin çözünür ifadesi için kullanıldı. Bu, E. coli'deki mikobakteriyel proteinlerin ekspresyonunun sorunlu olabileceği bildirildiği için dikkate değerdir [41].

Memeli hücrelerinde rekombinant protein ekspresyonu için aşağıdaki viral ekspresyon vektörleri mevcuttur: semliki orman virüsü [42] lentivirüs [43] adenovirüs [44] adeno-ilişkili virüs. Semliki orman virüsünün, ilaç keşfi ve yapısal genomik için membran proteinlerinin ekspresyonu için popüler olduğu kanıtlanmıştır [42]. Lentiviral ve adenoviral vektörler şu anda gen tedavisi alanında büyük ilgi görmektedir [45, 46]. Ayrıca transgenik hayvanların sütünde terapötik rekombinant proteinlerin ekspresyonuna da büyük ilgi vardır [47]. Transpozaza dayalı sistemler, uyuyan güzel vektörü gibi hiperaktif kurucu ifade için de popülerlik kazanmaktadır [48].

Hem yapısal biyoloji hem de ilaç keşfi/geliştirme için çoklu protein komplekslerinin rekombinant ekspresyonu için sistemler geliştirmeye son zamanlarda önemli bir ilgi olmuştur [49-52].

Dünya Çapında Protein Veri Bankası (wwPDB: http://www.wwpdb.org/) dört kuruluşun uluslararası bir işbirliğidir: RCSB PDB (ABD: http://www.rcsb.org/) MSD-EBI (Avrupa: http ://www.ebi.ac.uk/pdbe/) PDBj (Japonya: http://www.pdbj.org/) ve BMRB (ABD). WWPDB, "görevi küresel topluluğa ücretsiz ve kamuya açık olan makromoleküler yapısal verilerin tek bir PDB arşivini korumak" olan bir makromoleküler yapısal veri deposudur [53, 54]. wwPDB'deki yapıların büyük çoğunluğu proteinlerdir.

Protein ekspresyonu konusundaki mevcut uygulamamızı anlamak için, son 10 yıl içinde (2009'dan itibaren) yayınları olan PDB girişlerini seçiyoruz ve sonuçta 64713 kayda karşılık gelen 27096 makale çıkıyor.

wwPDB girişlerinin çoğu, 27096 yayından 23041'i (%85) kullanımını bildiren Escherichia coli'yi ifade ana bilgisayarı olarak gösterdi. Yaygın tür BL21'dir (11628 makale).

Tablo 2, bu konakçı organizmaların her biri için ilk 5 ekspresyon konakçısını ve ilk 2 veya 3 ekspresyon vektörünü listeler.

İfade ana bilgisayarıEn sık kullanılan ifade vektörleriYayınlar
Escherichia koli 23041
pET28 ve türevleri (Novagen/EMD Millipore) 2679
pET15 (Novagen/EMD Millipore) 863
pET21 (Novagen/EMD Millipore) 735
Spodoptera frugiperda 1493
pFastBac (Invitrogen/Life Tech) 228
pVL1392/3 (BD ​​Bioscience) 27
pFB-LIC-Bse 16
homo sapiens 1181
pHL-sn 92
pVRC8400 42
pTT5 17
trichoplusia ni 532
pFastBac 76
pAcGP67 15
Cricetulus griseus (CHO) 245
pEE serisi 12
PGS 8

Escherichia coli'nin wwPDB veri setinde çok önemli bir farkla en yaygın ifade konağı olması dikkat çekicidir. Escherichia coli, Gram negatif, çubuk şeklinde bir bakteridir. Yaşam bilimleri araştırmalarında anahtar model organizmalardan biridir ve hem akademik hem de endüstriyel ortamlarda kapsamlı bir şekilde kullanılmıştır. Dış zardaki lipopolisakkaritlerin, hücresel ve in vivo deneysel modellerde ciddi inflamatuar yanıtları ortaya çıkarabilen endotoksin kaynağı olduğuna dikkat edilmelidir. Protein ekspresyonu için kullanılan Spodoptera frugiperda hücreleri, Fall Armyworm'un yumurtalık dokularından türetilen hücre hatlarıdır (Sf 9 ve Sf 21). Novavax, bir COVID 19 aşısı üretmek için Sf 9 hücrelerinde modifiye edilmiş SARS-CoV-2 spike proteinini eksprese etti [55]. Trichoplusia ni hücreleri (ticari olarak High Five olarak mevcuttur), Cabbage Looper yumurtalık hücrelerinden türetilir. Trichoplusia ni'nin, bakulovirüs/böcek hücre sistemi kullanılarak salgılanan proteinlerin üretimi için Sf9 hücrelerinden daha iyi olduğu bildirilmektedir [56]. Trichoplusia ni hücreleri, rekombinant aşı üretimi için virüs benzeri partiküllerin üretimi için bir konakçı olarak Sf9 hücrelerinden de üstündür [57]. Pichia pastoris, tek karbon ve enerji kaynağı olarak metanol kullanabilen solunum yolu, metilotropik mayadır. Örneğin, Kitchen P ve diğerleri, Pichia pastoris'de [58] tam uzunlukta AQP4 proteini eksprese etti ve D Wrapp ve diğerleri, Pichia pastoris'te [59] pKai61 vektöründe iki değerli VHH'leri eksprese etti. Cricetulus griseus hücre hatları, Çin hamsteri yumurtalık hücrelerinden (CHO) elde edilir. Bu yaygın olarak kullanılan hücre çizgisi, süspansiyon büyümesine uyarlanabilir. Çoğu rekombinant antikor, CHO hücre dizilerinde üretilir. Örneğin Maun HR ve diğerleri, CHO DKO hücre hattında insan alfa- ve beta-triptaz genlerini eksprese etti [60].

Her ifade sunucusu için, en sık atıfta bulunulan ilk 2 veya 3 ifade vektörü, toplam yayınların yalnızca nispeten küçük bir bölümünü oluşturur (Tablo 2). Bu, her bir ifade ana bilgisayarı için kullanılmış olan çok çeşitli farklı ifade vektörlerini yansıtır. Şekil 1 ve 2, sırasıyla pET28 ve pcDNA3.3 (pcDNA3'ün en son versiyonu) için plazmit haritalarını göstermektedir. Bu plazmitler, sırasıyla E. coli ve memeli hücreleri için arketipsel ekspresyon vektörleridir.

pET vektörleri ile T7 RNA polimeraz promotörü, rekombinant genin ekspresyonunu yönlendirir. pET28 plazmidi, bir N-terminal His-etiketi/trombin bölünme bölgesi/T7-etiketi dizisini ve isteğe bağlı bir C-terminal His-Tag dizisini kodlar. Bu vektörler, E. coli'nin lambda DE3 lizojen suşları ile birlikte kullanılır. Bu suşlarda T7 RNA polimerazın genomik bir kopyasının ifadesi lac represörünün kontrolü altındadır. Rekombinant proteinin ekspresyonu, kültür ortamına izopropil-b-D-tio-galaktozid (IPTG) ilavesiyle indüklenir. İlginç bir şekilde, ekspresyonun diğer moleküller (örn., arabinoz) tarafından indüklendiği vektörler, wwPDB veri setinde belirgin bir şekilde yer almaz.

pcDNA3 serisi plazmitlerle, ekspresyon, insan sitomegalovirüsünün (CMV) hemen erken promotörü tarafından yürütülür. Bu, memeli hücrelerinde yapısal olarak aktif olan güçlü bir promotördür. pcDNA3, pcDNA3 vektör serisinin orijinal versiyonudur ve artık ticari olarak mevcut değildir. Bu vektör serisinin en son gelişimi pcDNA3.3'tür. pcDNA3'ün ayrıca resmi yayınların bir araştırmasında en yaygın olarak kullanılan memeli ekspresyon vektörlerinden biri olarak tanımlandığı belirtilmelidir (örneğin, Invitrogen'den pcDNA3.1 [61, 62] veya pcDNA3.3 (K8300-01) [63] ) .

En yaygın olarak kullanılan bakulovirüs/böcek hücresi vektörlerinin tümü, rekombinant proteinin yapısal ekspresyonunu yönlendirmek için güçlü polihedrin promotörünü kullanır. Plazmitler (bakülovirüs transfer vektörleri) protein ekspresyonunu doğrudan yönlendirmezler. Polihedrin promotörünün kontrolü altında ilgili geni içeren rekombinant bakulovirüs oluşturmak için kullanılırlar. pFastBac, rekombinant bakulovirüs oluşturmak için bölgeye özgü transpozisyonu kullanan yeni nesil bir plazmittir. Bu, pVL1392/3 ve pAcGP67 gibi daha eski nesil plazmitler için gereken 4-6 haftaya kıyasla, rekombinant bakulovirüs üretmek için geçen süreyi yaklaşık 2 haftaya düşürür.

Pichia pastoris vektörlerinin her ikisi de güçlü AOX1 promotörünü kullanır. İfade metanol tarafından indüklenir. Pichia pastoris, salgılanan proteinlerin üretimi için mükemmel bir sistem olmasına rağmen (aşağıya bakınız), wwPDB veri setinde en yaygın olarak kullanılan iki Pichia pastoris ekspresyon vektörünün her ikisi de sitoplazmik ekspresyon için tasarlanmıştır.

Tablo 2'deki veriler, yapısal araştırmalar için protein üretmek için özel olarak kullanılmış olan ekspresyon konakçılarına ve ekspresyon vektörlerine karşılık gelir. Sonuç olarak, bu veri seti, 3-boyutlu yapı belirleme çalışmaları için gerekli olan büyük miktarlarda saflaştırılmış protein üretebilen ekspresyon vektörlerine/konakçılarına karşı önyargılıdır. Escherichia coli'nin proteinleri glikosile edememesi ve böcek hücresi N-glikosilasyonunun enzimatik olarak uzaklaştırılabilme kolaylığı (bkz. Tablo 1), wwPDB veri setinde bu sistemlerin sık kullanımına da katkıda bulunabilir. Şeker molekülleri işlev için gerekli olmadığı sürece, yapısal çalışmalar için genellikle glikosile edilmemiş proteinler tercih edilir.

Diğer uygulamalar için (enzim deneyleri, hücresel deneyler, antikor üretimi için antijen üretimi, hücresel fonksiyon veya lokalizasyonu incelemek için aşırı ekspresyon gibi), bu tür önemli miktarlarda proteinin eksprese edilmesi ve saflaştırılması gerekli olmayabilir. Gerçekten de, hücre bazlı çalışmalar için rekombinant olarak eksprese edilen proteinin saflaştırılmasının dikkate alınması olası değildir. Bununla birlikte, wwPDB'den elde edilen ifade vektörleri/konakları hakkındaki veriler değerli bir kaynaktır. Veriler, birçok uygulama için protein ekspresyon projelerine rehberlik edebilir.

wwPDB veri setinin potansiyel yanlılığından kaçınmak için Labome, plazmitlerden alıntı yapan rastgele seçilmiş bir dizi resmi yayın araştırdı. En yaygın olarak kullanılan ilk 3 ekspresyon vektörü grubu Tablo 3'te gösterilmektedir. wwPDB veri seti için gözlemlendiği gibi, en sık alıntılanan ekspresyon vektörleri toplam yayınların sadece küçük bir bölümünü oluşturmaktadır. Yine, bu, araştırmacıların herhangi bir ifade konağı için kullandığı ifade vektörlerinin çeşitliliğini yansıtır. Vektör pcDNA3.1, yapıcı CMV promotörü aracılığıyla memeli hücrelerinde ekspresyonu yönlendirir (yukarıya bakın). Plazmit pGL3, memeli gen ekspresyonunun düzenlenmesinin nicel çalışması için tasarlanmış bir lusiferaz raportör vektörüdür. Bu vektörün artan popülaritesi, muhtemelen, araştırmacıların insan genomunun işlevini hem transkripsiyonel hem de proteomik seviyelerde inceleme arzusunu yansıtıyor.

Benzer şekilde, pEGFP, ekspresyonun yapısal olarak CMV promotörü tarafından yürütüldüğü bir memeli ekspresyon vektörüdür. Gelişmiş yeşil floresan proteini (EGFP), ilgilenilen protein ile bir N-terminali (pEGFP-C1) veya bir C-terminali (pEGFP-N1) füzyonu olarak ifade edilir. Bu pEGFP vektörleri, EGFP floresansını izleyerek proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu veya ticaretini incelemek için kullanılabilir [64, 65]. pRK5 ifade vektörü [66] gibi diğer vektörler de kullanılır.

VektörPMIDEv sahibiOrtak varyant Referans
pcDNA3.1 (Invitrogen) 83 Memeli hücre hatları pcDNA 3.1 Onun
pcDNA 3.1 V5
[67, 68]
pGL3 (Promega) 44 Memeli hücre hatları [68]
pEGFP (Clontech) 40 Memeli hücre hatları pEGFP-C1
pEGFP-N1
[69]

Hem yayın araştırmasında hem de wwPDB veri setinde en yaygın olarak kullanılan memeli ifade vektörlerinin kurucu ifadeyi yönlendirmesi dikkate değerdir. Bu, ApoE3 proteinlerinin [70] veya diğer proteinlerin [67] üretiminde kullanılan Thermo Fisher Flp-In T-REx 293 hücreleri gibi T-Rex sistemi gibi uyarılabilir memeli ekspresyon vektörlerinin ticari mevcudiyetine rağmen, GE Healthcare [71] veya pF12 RM Flexi sistemi. Akademik yayınlarda yüksek oranda yer almamasına rağmen, BacMam sisteminin hem hücresel çalışmalar hem de saflaştırma için proteinleri eksprese etmede farmasötik endüstrisinde popüler olduğu kanıtlanmıştır [72-74] ve şimdi ticari olarak mevcuttur. BacMam, normal promotörün, memeli hücresinde aktif CMV promotörü ile değiştirildiği modifiye edilmiş bir bakulovirüs kullanır. BacMam virüsü, çok çeşitli memeli hücre tiplerinde replikatif olmayan, litik olmayan ekspresyonu yönlendirir.

Araştırma ortamlarından farklı olarak, yeni onaylanmış protein farmasötiklerinin üretimi genellikle memeli ekspresyon sistemlerindedir. Gary Walsh, Ocak 2014'ten Aralık 2018'e kadar ABD/AB düzenleyici makamları tarafından onaylanan protein ilaçlarının üretiminde kullanılan ifade sistemlerini özetledi [79]. 62 yeni rekombinant protein farmasötik ürününden elli ikisi, memeli hücre dizilerinde, biri (Sebelipaz alfa) bir memeli transgenik sisteminde, 5'i E. coli'de ve 4'ü S. cerevisiae'de eksprese edilir. CHO hücre bazlı sistemler en yaygın memeli ekspresyon konakçısıdır. Aynı dönemde onaylanan 68 monoklonal antikor ilacı (yeni veya biyobenzer) arasından 57'si CHO hücre dizilerinde, 9'u NS0 hücrelerinde ve 2'si Sp2/0 hücrelerinde üretilir.

Sık karşılaşılan bir problem, eksprese edildikleri konakçı hücreler için toksik olan rekombinant proteinlerin ekspresyonudur. Bu sorunun üstesinden gelmek için çeşitli stratejiler mevcuttur. Araştırmacı genellikle, belirli proteinleri için hangi potansiyel çözümün en iyi sonucu verdiğini ampirik olarak belirlemelidir. Literatür emsali, hedef sınıf bilgisi ve hedef proteinin 'kurum içi' deneyimi, strateji seçimine rehberlik etmek için kullanılabilir.

  • araBAD promotörünü (Invitrogen/Life Sciences) kullanan pBAD sistemi gibi sıkı bir şekilde düzenlenmiş (yani sızdırmayan) ekspresyon sistemleri, bazal ekspresyonu en aza indirmek için kullanılabilir [80].
  • T7 promotör bazlı plazmitlerle, T7 RNA polimerazını inhibe eden ve böylece IPTG indüksiyonundan önce promotör aktivitesini azaltan T7 lizozimini eksprese eden pLysS/pLysE/pLysY konakçı hücrelerin kullanılmasıyla indüksiyon öncesi ekspresyon azaltılabilir. Benzer şekilde, IPTG ile indüksiyondan önce promotör aktivitesini bastırmak için glukoz kullanılabilir [80].
  • pETcocoTM sistemi (EMD Millipore), hücre büyümesi sırasında plazmit kopya sayısının çok düşük bir seviyede tutulmasına izin vererek, indüksiyondan önce bazal ekspresyonu en aza indirir ve plazmit stabilitesini en üst düzeye çıkarır. Plazmit kopya sayısı belirgin şekilde yukarı doğru düzenlenir ve IPTG tarafından indüklenen hedef gen ekspresyonu [80].
  • Diğer bir yaklaşım, toksik proteinleri ebeveyn BL21(DE3) suşundan (Avidis, Lucigen) [80] daha etkili bir şekilde ifade etme yetenekleri nedeniyle ampirik olarak seçilen C41(DE3) ve C43(DE3) gibi konakçı suşları kullanmaktır.
  • Maltoz bağlayıcı protein, GST, tioredoksin veya SUMO gibi füzyon etiketlerinin deneysel olarak taranması, hedef proteinin (Invitrogen/Life Sciences, New England Biolabs, LifeSensors) [80] toksisitesinin üstesinden gelen bir füzyon partneri belirleyebilir.
  • Ekspresyonun periplazmaya yönlendirilmesi, potansiyel olarak sitozolik birikim ile ilişkili toksisitenin üstesinden gelebilir [80].
  • Toplu beslenen kültür, toksik proteinlerin ekspresyonu için de yararlı bir yaklaşım olabilir [81].

Birçok memeli ekspresyon sistemi, yapısal olarak aktif bir CMV promotörü kullanır. Bu, konakçı hücreler için toksik olan proteinlerin ekspresyonu için sorunludur. Bununla birlikte, araştırmacılar sıklıkla bu tür proteinlerin hücresel işlevini incelemek veya tam memeli hücresi translasyon sonrası modifikasyonları taşıyan bu tür proteinleri eksprese etmek ve saflaştırmak isterler. Güçlü CMV promotörünü kullanan çoklu uyarılabilir memeli ekspresyon sistemleri, ekspresyonun tetrasiklin (T-RexTM Invitrogen/Life Sciences, Tet-On 3G Clontech), ecdysone (Agilent Technologies/Stratagene) ve IPTG (pTUNE) tarafından indüklendiği ticari olarak mevcuttur. Origenes). Bu sistemler, hedef proteinin uyarılmasından önce yeterli hücre sayısının büyümesini kolaylaştırır. Nakagawa T, GluA2 iyon kanalının aktivasyonu ile toksisiteyi hafifletmek için HEKTetON hücresinde (CLONTECH) bir DualTetONGluA2-FLAG/CNIH3-1D4 plazmidini eksprese etti [82].

Belirli bir ekspresyon sistemi başarısız olursa, diğer hususlar izin veriyorsa (örn., son kullanım, translasyon sonrası modifikasyonlar) farklı bir sisteme (örn., maya, böcek, bakteri, memeli) geçmek avantajlı olabilir. Bir sistemde toksik olan bir protein diğerinde toksik olmayabilir [80].

Nispeten küçük miktarlarda (saflaştırılmış) protein gerekiyorsa, hücresiz protein üretimi, hücresel toksisite sorunlarını aşmak için çekici bir seçenektir [80].