Bilgi

Mikrotiter Çanak Biyofilm Oluşum Testi- Pseudomonas ve Kristal Violet

Mikrotiter Çanak Biyofilm Oluşum Testi- Pseudomonas ve Kristal Violet


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Pseudomonas bir gram negatif bakteri ise, kristal menekşe tutmaz ama neden bu kadar çok insan Mikrotiter Çanak Biyofilm Oluşum Testinde kristal viyole boyama kullanıyor?


G- ve + arasındaki ayrım için Gram boyamanın kullanılması, Gram boyamada kritik adım olan alkolün eklenmesini gerektirir. Aslında ilk adım olan basit boyama tüm bakteri türleri için aynıdır. Tüm bakteriler lekeyi alır, ancak alkol eklenmesi Pseudomonas gibi bakterilerdeki lipidin onu kaybetmesine neden olur.


Mikrobiyolojide Sınırlar

Editör ve hakemlerin bağlantıları, Loop araştırma profillerinde sağlanan en son bilgilerdir ve inceleme sırasındaki durumlarını yansıtmayabilir.


  • Makaleyi İndir
    • PDF İndir
    • Okuma Küpü
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Tamamlayıcı
      Malzeme
    • EndNote
    • Referans Yöneticisi
    • Basit METİN dosyası
    • BibTex


    PAYLAŞ

    Tanıtım

    Biyofilmler, bakteri türevli DNA, proteinler ve ekzopolisakkaritlerden oluşan hücre dışı bir matrisle çevrili, canlı veya abiyotik yüzeylere bağlı üç boyutlu bakteri topluluklarıdır 1,2,3. Doğada, bakterilerin esas olarak biyofilm şeklinde bulunduğu kabul edilir ve toplam mikrobiyal biyokütlenin %0,1 kadar azının aslında planktonik büyüme modunda olduğu tahmin edilmektedir 4 .

    Biyofilm gelişimi, bir yüzey oluşturan mikrokolonilerle birleşen bakteriler tarafından başlatılır. Daha sonra bunlar, bakteri hücre yoğunluğu ve besinlerin mevcudiyeti dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlı olarak olgun biyofilmlere dönüşür. Bununla birlikte, biyofilmlerin tam gelişimine yol açan karmaşık yollar, tam olarak anlaşılmamıştır, ancak çok sayıda karmaşık düzenleyici gen ağlarını 5 etkileyen çekirdek algılamayı içerir. Bir biyofilm oluşumu pH, UV hasarı, hidrojen peroksit ve metal toksisitesi gibi çevresel strese karşı bir hayatta kalma stratejisi olarak kabul edilir, aynı zamanda fagositoz 5,6 dahil olmak üzere bakteriyel enfeksiyona karşı insan bağışıklık tepkisine karşı da kabul edilir. Biyofilm oluşturabilmesiyle özellikle kötü nam salmış bir bakteri, P. aeruginosa. Birçok ortamda biyofilm oluşturabilir ve çok çeşitli kronik enfeksiyonlara neden olabilir 7 . Ayrıca, kistik fibrozlu (CF) hastalarda önemli bir hastane patojenidir 8,9 . Biyofilm büyümesinin klinik önemi ve göreceli kolaylığı, bu bakteriyi biyofilm oluşumu 10 araştırmaları açısından model bir organizma haline getirmiştir.

    Pek çok kronik enfeksiyonun biyofilm ile ilgili olduğuna dair artan bir farkındalık var. Aslında, NIH, gelişmiş dünyada doktorlar tarafından tedavi edilen tıbbi bakteriyel enfeksiyonların muhtemelen yüzde 80'inin biyofilmlerde büyüyen organizmalardan kaynaklandığını kabul etti 11 . Bununla birlikte, bakteri fizyolojisini karakterize eden araştırmaların çoğu, sıvı ortamdaki planktonik bakteriler üzerinde yapılmıştır. Benzer şekilde, mevcut tüm antibiyotiklerin ve diğer antimikrobiyal ürünlerin keşfi de planktonik bakterilere 7 yönelik aktiviteye dayanmaktadır. Daha sonra, yerleşik biyofilmler, antibiyotik tedavisine planktonik bakterilerden 1000 kata kadar daha dirençli olabilir ve bu da onları mevcut tedavilere karşı çok dirençli hale getirir 12 . Bunun nedeni kısmen, çoğu antimikrobiyalin esas olarak hızla büyüyen hücrelere karşı etkili olmasıdır. Bununla birlikte, biyofilmin ekzopolimer matrisinin, maddelerin difüzyonunu kısıtlayabilmesi ve antibiyotikleri ve konağın bağışıklık sisteminin bileşenlerini bağlayabilmesi de dahil olmak üzere birkaç başka neden tanımlanabilir 12,13.

    Mevcut antibiyotikler ile anti-biyofilm aktivitesi arasındaki uyumsuzluk, kronik biyofilm ile ilgili enfeksiyonlarla mücadele için optimal stratejide yeniden düşünmeye ve yeni antimikrobiyaller için yoğun bir araştırmaya yol açmıştır. Bu tür yeni anti-biyofilm bileşiklerinin bir sınıfı, Konak Savunma Peptidleri (HDP'ler) tarafından oluşturulabilir. Başlangıçta antimikrobiyal peptitler olarak adlandırılan bu peptitler, mikrobiyal enfeksiyonlar ve iltihaplanma 14 dahil olmak üzere hakaretlere karşı konak savunmasında görev yapan evrimsel olarak korunmuş moleküllerdir. Son yıllarda, anti-biyofilm aktiviteleri için artan bir takdir olmuştur. Örneğin, insan katelisidin LL-37'nin biyofilm oluşumunu engellediği gösterilmiştir. P. aeruginosa 0.5 μg/ml'de ve 4 μg/ml'de önceden oluşturulmuş biyofilmleri dağıtır, fizyolojik koşullar 10 altında planktonik bakterilere karşı MIC değerinin çok altında. Bununla birlikte, özellikle doğal olarak oluşan çok sayıda HDP göz önüne alındığında, önceden oluşturulmuş biyofilmlerin 10,14,15,16 yok edilmesiyle ilgili yalnızca sınırlı sayıda makale bulunmaktadır.

    Burada, doğal olarak oluşan katelisidinlerin ve sentetik olarak geliştirilmiş HDP bazlı peptit IDR1018'in aşağıdakilere karşı aktivitelerini belirlemek için tasarlanmış çalışmaların sonuçlarını rapor ediyoruz. P. aeruginosa biyofilmler. Birkaç HDP, yerleşik biyofilmlerin biyofilmle ilişkili bakterilerinin canlılığını önemli ölçüde azaltırken, bir HDP (CRAMP) tüm biyofilmi verimli bir şekilde yok edebildi.


    Patojenik Leptospira ile Biyofilm Oluşumunun Kantifikasyonu için Mikrotitre Plaka Testi

    Arka Plan ve Amaç: Biyofilm oluşumu bakteriyel patogenezin kurulması ve hastalık kontrolü için önemlidir. Hücre agregatlarının oluşumu, memeli bakım konağının renal tübüllerinin patojenik Leptospira tarafından uzun süreli kolonizasyonuna katkıda bulunmuştur. Bu çalışma, Sarawak, Malezya'daki sıçanlardan, toprak ve su örneklerinden izole edilen 29 patojenik Leptospira suşu arasındaki biyofilm oluşumunu ölçmeyi amaçladı. Malzemeler ve yöntemler: Orta üstel kültürlerden yaklaşık 106 bakteri mL ם'lik bir başlangıç ​​bakteri süspansiyonu inokulum hazırlandı. Biyofilm tahlili daha sonra 24 oyuklu mikrotitre plakalarında üç kopya halinde gerçekleştirildi. Elde edilen optik yoğunluğa dayalı olarak biyofilm oluşturma yeteneklerini değerlendirmek için kristal menekşe tahlili yapıldı. Yapışma kuvvetine göre, biyofilm oluşturma yetenekleri dört farklı kategoride sınıflandırıldı: yapışmayan, zayıf yapışan, orta derecede yapışan ve kuvvetli şekilde yapışan. Sonuçlar: Test edilen bakterilerin her birinin %32.26'sı 1. günde ya yapışmayan ya da zayıf yapışan biyofilm üreticileri olarak sınıflandırıldı. 2. günden 5. güne kadar çoğu, orta ve güçlü bir şekilde yapışık biyofilmler üretti. Tüm izolatlar 6. günden 10. güne kadar güçlü bir şekilde tutundu. En yüksek biyofilm üretimi 7. ila 8. günlerde fark edildi. Bu çalışmada, sıçanlar, toprak ve su örnekleri arasında en güçlü biyofilm üreticileri, OD 600 ile 8. günde 16.700'de ve artımn0.265'te P38, OD 600'de 21.760'ta ve artımn0.332'de ve 7.günde OD 600'de P22 ile 19.793±0'da P22'dir. 144, sırasıyla 7. günde. Çözüm: Sonuç olarak, test edilen tüm Leptospira, çeşitli çevresel habitatlarda hayatta kalmaya katkıda bulunan ve hastalık bulaşmasında beklenen güçlü biyofilm üretebildi.

    Bu makaleden nasıl alıntı yapılır:

    Chai Fung Pui, Kasing Apun, Jennifer Jalan, Lesley Maurice Bilung, Lela Su'ut ve Hashimatul Fatma Hashim, 2017. Patojenik Leptospira Tarafından Biyofilm Oluşumunun Nicelenmesi için Mikrotitre Plaka Testi. Araştırma Mikrobiyoloji Dergisi, 12: 146-153.

    Doğada, patojenik bakteriler de dahil olmak üzere mikroorganizmalar, planktonik kültürler halinde toplu çözeltide nadiren serbestçe bulunurlar. Bunun yerine, biyofilm 1,2 oluşturan bir yüzeye bağlı bir birim olarak var olmaya eğilimlidirler. Biyofilm, insan diş yüzeylerinden 3 kazıdığı "Hayvanlar" kümelerinin mikroskop altında gözlemlendi. O zamandan beri, biyofilm, bir alt tabakaya veya birbirine geri döndürülemez bir şekilde bağlı olan ve Hücre Dışı Polimerik Maddelerin (EPS) 4,5 kendi ürettiği yapışkan matrisine gömülü olan bakterilerin sapsız topluluğu olarak tanımlanmıştır.

    Bakteriyel yapışma, biyofilm oluşumu 6 sürecindeki ilk adımdır. Uygun koşullar altında hemen hemen tüm bakteri türleri biyotik (hayvan ve bitki dokuları) ve abiyotik (plastik, cam, metal, ahşap) yüzeylere yapışabilir 7,8 . Hem patojenik hem de saprofitik Leptospira'nın ayakta duran kültürlerde 9 yüzeyle ilişkili biyofilmler oluşturduğu bildirilmiştir. Picardeau ve ark. 10, L. interrogans ve L. biflexa tarafından katı yüzeylerde güçlü biyofilm üretildiğini belirtmiştir.

    Leptospira spp'nin yapışması. hücreleri barındırmak için leptospirosis enfeksiyon 11 için ilk adım olarak gereklidir. Aşınma yoluyla konakçıya nüfuz ettikten sonra, patojenik Leptospira, kanda çoğaldıkça ve endotelyal ve epitelyal hücrelere yapışırken hedef organları verimli bir şekilde kolonize eder. Öte yandan, saprofitik Leptospira, fagositoz 12 ile kan dolaşımından hızla temizlenir. Biyofilm oluşumu patojenik Leptospira'nın renal tübüllerde kolonize olmasını kolaylaştırırken, saprofitik Leptospira'nın su gibi belirli çevresel nişleri işgal etmesini kolaylaştırır 10.

    Farklı hayvan konakçılarında ve çevrelerinde patojenik Leptospira ile ilgili çeşitli prevalans çalışmaları dünya çapında rapor edilmiştir. Daha önceki çalışmalarımızda Leptospira spp. Sarawak, Malezya'daki milli parklardan gelen çevresel toprak ve su 13 ve ayrıca Leptospira spp. Sarawak, Malezya 14 . Patojenik Leptospira'nın mevcudiyeti, biyofilm oluşturma yetenekleriyle kolaylaştırılabilen konakçı ve çevredeki adaptasyonlarını ifade eder. Bu nedenle, bu çalışma, mikrotiter plaka testi kullanılarak önceki çalışmalardan elde edilen patojenik Leptospira izolatlarında biyofilm oluşumunu değerlendirmeyi amaçlamıştır. İzolatlar ayrıca biyofilm oluşturma yeteneklerine göre farklı kategorilere ayrıldı.

    Bakteriyel izolatlar ve büyüme durumu: Universiti Malaysia Sarawak, Kaynak Bilimi ve Teknoloji Fakültesi, Moleküler Biyoloji Bölümü, Mikrobiyoloji Laboratuvarı'ndan toplam 29 patojenik Leptospira izolatı elde edildi. İzolatların detayları Tablo 1'de verilmiştir. Leptospira noguchii ve L. interrogans, pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Tüm kültürler, 100 µm mL ם 5-florourasil ile modifiye edilmiş yarı katı Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH) et suyunda oda sıcaklığında tutuldu.

    Başlangıç ​​bakteri süspansiyonunun hazırlanması: Orta üstel kültür, stok kültürünün modifiye edilmiş yarı katı EMJH broth içinde 1 hafta süreyle inkübe edilmesiyle hazırlandı. Daha sonra spektrofotometre (Metertech Inc.) kullanılarak 420 nm'de yaklaşık 0.3-0.4 optik yoğunluğa standartlaştırıldı ve bu da yaklaşık 108 bakteri mL ם'e karşılık geldi. Daha sonra bu orta üstel kültürden 15 106 bakteri mL'lik bir başlangıç ​​bakteri süspansiyonu aşısı hazırlandı.

    Mikrotitre plakası biyofilm tahlili: Biyofilm tahlili, 24 oyuklu mikrotitre plakalarında (doku kültürü ile muamele edilmiş, düz tabanlı kuyular TPP) üç kopya halinde gerçekleştirildi. EMJH suyu, negatif kontrol olarak kullanıldı. Mikrotitre plakası biyofilm tahlilini gerçekleştirme prosedürü Ristow ve ark. 9 ve Lee ve diğerleri. 16 .

    Kısaca, 10 gün boyunca her gün 24 saatlik zaman aralığı ile sıvı kültür çıkarıldı. Yapışmayan planktonik hücreyi uzaklaştırmak için kuyucuklar distile su ile nazikçe yıkandı. Daha sonra, %2 sodyum asetat kullanılarak fiksasyondan önce 15 dakika boyunca havada kurumaya bırakıldı. Sodyum asetat solüsyonu çıkarıldı ve tekrar havada kurumaya bırakıldı. Hücreler, 20 dakika boyunca 900 &uL %1 kristal viyole solüsyonu kullanılarak boyandı, ardından kristal menekşe solüsyonu çıkarıldı. Hücreler daha sonra üç kez distile su ile yıkandı. Son olarak, oyuklarda kalan kristal menekşe, 600 nm'de (OD600) optik yoğunluk ölçümünden önce 1 mL etanol/aseton (80/20 v/v solüsyon) içinde çözündürüldü. Kristal morun arka plan boyamasını düzeltmek için, negatif kontrolün 600 nm'sindeki ortalama optik yoğunluk, patojenik Leptospira tarafından biyofilm oluşumunun 600 nm'deki ortalama optik yoğunluğundan çıkarıldı. Sonuçlar ortalama&artı standart sapma olarak sunuldu.

    Biyofilm oluşturma yeteneğinin izolatlara göre sınıflandırılması: Leptospira'nın biyofilm oluşturma yeteneği Stepanovic ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi belirlendi. 17, Marinho ve diğerleri. 7 ve Saxena ve ark. 18. 29 patojenik Leptospira izolatının biyofilm oluşturma yetenekleri ve her gün pozitif kontroller, elde edilen optik yoğunluğa göre dört kategoride sınıflandırıldı. Optik yoğunluk sınır değeri (ODc), negatif kontrolün ortalama optik yoğunluğunun (OD) üzerindeki üç standart sapma olarak tanımlanır.

    Bu dört kategori, OD

    İstatistiksel analiz: İstatistiksel analiz, SPSS sürüm 20.0 yazılımı (IBM Corporation, NY, ABD) kullanılarak yapıldı. Değişkenler için ortalamalar arasındaki farklar, tekrarlanan ölçümler ANOVA kullanılarak değerlendirildi. Biyofilm OD 600 ortalama değerlerini karşılaştırmak için post hoc Bonferroni testi kullanıldı. Anlamlılık düzeyi p<0.05 olarak belirlendi.

    Bu çalışmada, 10 inkübasyon günü boyunca test edilen tüm Leptospira izolatları için mikrotitre plakası biyofilm testi kullanılarak biyofilm oluşumu Şekil 1, 2 ve 3'te gösterilmektedir. Verilerin güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için testler üç kopya halinde gerçekleştirildi. İstatistiksel analiz, bu bakterilerin biyofilm oluşumunda zamanın etkisinde önemli bir fark olduğunu göstermiştir (p<0.05). Bu bakterilerin de biyofilm oluşturmada kendi aralarında istatistiksel olarak anlamlı farklılık gösterdiği bulundu (p<0.05).

    Şekil 1, 2 ve 3'e dayanarak, test edilen tüm Leptospira izolatlarının biyofilm büyümesi üzerinde benzer bir model gösterdiği gözlemlendi. 1. ve 2. günde, OD600 ile gösterildiği gibi oluşan biyofilm miktarı hala düşüktü. Miktar, yapışan bakteri sayısındaki artışı gösteren 3. günden itibaren artmaya başlar. Ortalama olarak, en yüksek biyofilm OD 600 ortalama değerleri 7. veya 8. günde elde edilmiştir, bakteriler arasında değişmektedir. En yüksek noktaya ulaştıktan sonra biyofilm OD 600 ortalama değerlerinde bir düşüş oldu. Her gün farklı biyofilm oluşturma yeteneklerine sahip test edilen bakteri sayısı Tablo 2'de gösterilmektedir. İncelenen 29 patojenik Leptospira izolatı ve 2 pozitif kontrol arasında, her biri %32.26'sı 1. günde yapışmayan veya zayıf yapışan biyofilm üreticileri olarak sınıflandırıldı. Çoğunluğu 2. günden 5. güne kadar orta derecede ve güçlü bir şekilde yapışan biyofilmler üretti. Hepsi 6. günden itibaren güçlü bir şekilde yapışma yetenekleri elde ettiler ve 10. güne kadar güçlü bir şekilde bağlı kaldılar.

    Mikrotitre plakası biyofilm testi kullanılarak değerlendirilen biyofilm üretimi, 6. günün sonucunda gösterildiği gibi bu çalışmada %100 güçlü biyofilm üreticileri ortaya çıkardı. Sıçan izolatları arasında en güçlü biyofilm üreticisi, 8. günde OD 600 ile 16.700±0.265 ile P38'dir. İncelenen 14 toprak örneğinden P18, 7. günde 21.760±0.332 OD 600 ile en güçlü biyofilm üreticisidir.

    Su numuneleri için P22'nin 7. günde 19.793±0.144 OD 600 ile en güçlü biyofilm üreticisi olduğu bilinmektedir. Post hoc Bonferroni testi, ikili karşılaştırmalar yapıldığında bu üç izolatın (P18, P22 ve P38) birbirinden istatistiksel olarak farklı olduğunu ve biyofilm oluşumunda pozitif kontroller olduğunu gösterdi (p<0.05).

    Bakteriler tarafından biyofilm oluşumu genellikle farklı bağlanma (tersinir ve tersinmez), büyüme ve ayrılma 1 aşamaları ile karakterize edilir. Bu çalışmada, patojenik Leptospira izolatlarının, diğer bakterilere farklı süreç taklitleri yoluyla biyofilm geliştirdiği bulunmuştur. Sonuç, 29 patojenik Leptospira izolatının ve pozitif kontrollerin tümü için 24 oyuklu mikrotitre plakalarının dibinde biyokütle oluştuğunu gösterdi. İşlem, Leptospira hücrelerinin 24 oyuklu mikrotitre plakalarının yüzeyine ulaşması ve bağlanmasıyla başladı. Hücre yapışmasının ardından, yüzey algılama tepkileri geliştirdiler ve çevredeki besinleri ve sıvıları 16,1 hapseden şartlandırma filmine yapıştılar.

    1-6 gün arasında, bağlı hücreler mikrokoloniler oluşturdular ve ekzopolisakkarit matriksinin mevcudiyeti ile bir arada tutuldular. Bu matris, hücreleri stresli çevresel koşullardan 19 koruyan hücre dışı DNA, proteinler ve ölü hücre kalıntıları içeriyordu. Bu mikrokoloniler 7. ve 8. günlerde üç boyutlu yapılara sahip makrokoloniler olarak olgunlaşana kadar genişledi ve çoğaldı.

    Olgunlaşmadan sonra, makrokoloniler içindeki bakteriler dağıldı ve ya planktonik kültürler olarak hayatta kaldı ya da ölmeye başladı. Sonuç olarak, bu çalışmada patojenik Leptospira tarafından biyofilm oluşumu süreci dinamik ve genetik olarak düzenlenmiş bir süreç olarak düşünülebilir. Bu, Hu ve arkadaşlarının önceki çalışmasına uygundu. 20 farklı bakteri türlerinin benzer süreçlerle biyofilm ürettiğini gözlemleyerek biyofilm oluşumunun genetik olarak düzenlenmiş bir süreç olduğunu öne sürmüştür. Benzer bir gözlem Sun ve ark. 21 Staphylococcus aureus'un biyofilm oluşumu dinamik bir süreçtir.

    Biyofilm oluşumunun belirlenmesi farklı yöntemler kullanılarak değerlendirilmiştir, ancak farklı bakteri türlerinin biyofilm oluşturma yeteneğini belirlemek için standart bir protokol oluşturulmamıştır. Örneğin, bir kültür tüpünü kaplayan bakteri filmi genellikle katyonik bir boya ile boyanır ve tüp test yönteminde görsel olarak ölçeklenir. Bu yöntem niteldir ve bu nedenle sonuç yorumunda özneldir 17 . Bu çalışmada, lekeli Leptospira biyofilminin optik yoğunluğunun spektrofotometrik olarak belirlendiği mikrotitre plaka testi seçilmiştir.

    Mikrotiter plaka tahlili, yalnızca kuyunun dibinde biyofilm tespitinin büyük dezavantajından muzdarip olsa da, bu tahlil, biyofilm niceleme 22,18'de en sık kullanılan yöntem olarak kabul edilir. Mikrotiter plaka testinden elde edilen optik yoğunluk ölçümü, elde edilen sonuçların yorumlanmasında tüp testinin sübjektifliğini ortadan kaldırır ve klinik uygunluğu tüp testinden 17 daha güvenilir şekilde tahmin eder. Ayrıca, bu çalışmada kullanılan kristal viyole, resazurin veya dimetil metilen mavisi gibi farklı boyaların uygulanması, kantitatif biyofilm ölçümü 23 sağladığında, mikrotitre plaka testinin yapılması kolaydır.

    Bu çalışmada, kristal viyole boyama ile gösterilen biyofilm miktarı, 7. ve 8. günlerde yaklaşık 12 olan maksimum OD 600 ortalama değerlerine ulaşmak için zamana bağlı bir şekilde arttı. Bu değer Ristow ve diğerleri tarafından yapılan çalışmanın aksinedir. Bir saprofit olan Leptospira biflexa için 2 günlük inkübasyonun ardından kristal viyole boyamanın ardından yaklaşık 2 olan maksimum OD 600 ortalama değerlerini bildiren 9 kişi.

    En yüksek biyofilm hücre doygunluğunda (7. ve 8. gün), patojenik Leptospira için absorbans değeri, saprofitik Leptospira 9'dan yaklaşık 6 kat daha yüksekti. Bu nedenle, patojenik Leptospira'nın saprofitik Leptospira'dan önemli ölçüde daha yüksek biyofilm oluşumu ürettiği sonucuna varıldı. Brihuega ve arkadaşları tarafından daha önceki bir çalışmada. 24, L. interrogans serovar Pomona ve L. biflexa serovar Patoc domuz izolatının biyofilm oluşumunu değerlendirmek için, patojenik suşun, 5. günde saprofitik suşa kıyasla daha kalın bir biyofilm tabakası geliştirdiği bulundu. Ayrıca L. interrogans'ın Azospirillum brasilense hücreleri ile bir arada bulunması yoğun bir biyofilm tabakası oluşturmuş ve burada 2. günde 25 lamlarda maksimum hücre aderansına ulaşmışlardır.

    Patojenik ve saprofitik Leptospira'nın biyofilm oluşumundaki farklı yeteneklerini destekleyen bir başka neden de, patojenik Leptospira'da tanımlanmış ancak saprofitik Leptospira'da olmayan bazı kolonizasyon faktörlerinin keşfedilmesidir. Bu, ilk enfeksiyona katkıda bulunan farklı adezinlere atfedilebilir. L. interrogans serovar Icterohaemorrhagiae'nin dış kılıfından izole edilen 36 kDa fibronektin bağlayıcı proteinin sadece patojenik suşlarda 12,26 bulunduğu bilinmektedir.

    Patojenik Leptospira izolatları için OD 600 ortalama değerlerinin 8. ve 9. günlerde düştüğü fark edildi. Charyeva ve arkadaşlarının önceki çalışması. 27, Staphylococcus epidermidis tarafından üretilen biyofilmin 3 ila 7 gün arasında azaldığını ortaya koydu. Ristow ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışmada. 9 , saprofitik Leptospira izolatları için OD 600 ortalama değerlerinin 3. günde düştüğünü belirtmişlerdir. Böylece, bu, patojenik Leptospira'nın biyofilm üretme yeteneğini saprofitik Leptospira'dan daha iyi sürdürebileceğini gösterdi. Biyofilmi sürdürme yeteneğinin, Leptospira suşları tarafından enfeksiyona etkisi olabilir. Mukoza zarına veya aşınmış cilde maruz kaldıktan sonra, patojenik Leptospira, doku bariyerlerini ve kan istilasını geçerek hızla sistemik enfeksiyon oluşturur. Kollajen tip I, tip IV, laminin ve fibronektin 28 gibi hücre dışı matris bileşenlerine yapışırlar. Atzingen ve ark. 29 hücre dışı matrikse bağlanmanın virülans ile ilişkili olduğunu, çünkü hücre dışı matrikse bağlanmanın patojenik Leptospira'da orta ve saprofitik Leptospira'dan daha etkili olduğunu belirtti.

    Biyofilm üretim miktarındaki değişkenlik, bu çalışmada gösterildiği gibi, patojenik Leptospira'dan farklı izolatlar farklı yapışma yeteneklerinde biyofilm ürettiği için yaygındır. Bununla birlikte, Stepanovic ve diğerleri tarafından kullanılan sınıflandırmaya dayanmaktadır. 17'de izolatların tümü, mikrotitre plakaları üzerinde güçlü biyofilm oluşturan güçlü biyofilm üreticileri olarak kabul edilir. Patojenik Leptospira'daki güçlü biyofilm üretimi, çeşitli ortamlarda hayatta kalmak için önemli bir faktördür. Leptospirosis yaygın olarak patojenik Leptospira'dan kaynaklandığından, bu daha sonra dolaylı olarak Leptospira patogenezine katkıda bulunacaktır. Bu Hu ve ark. Bakteriler tarafından biyofilm oluşumunun birçok bakteriyel enfeksiyonun patogenezinde önemli olduğundan bahseden 20. Tüm insan bakteriyel enfeksiyonlarının %60'ından fazlası, ilgili bakteriler 30 tarafından biyofilm oluşumunun kalıcılığına bağlanmıştır. Bakteri patojenleri, konukçu kurulmasına, popülasyonun genişlemesine ve en önemlisi hastalık proliferasyonuna 31 yardımcı olmak için biyofilm gelişimine güvenebilir.

    Bu çalışmada, patojenik Leptospira izolatları arasında biyofilm oluşturma yeteneklerini değerlendirmek için basit bir biyofilm ölçümü yöntemi olan mikrotitre plakası biyofilm tahlili başarıyla kullanılmıştır. Genel olarak, bu çalışmada incelenen 29 Leptospira izolatı, güçlü biyofilm üretme yeteneğine sahiptir, ancak oluşan biyofilm miktarı izolattan izolata farklıydı. Biyofilmin insan enfeksiyonunun patogenezindeki rolü inkar edilemez. Biyofilm oluşumu tıp alanında, halk sağlığında, endüstride ve çevrede ciddi sonuçlara yol açabilmektedir. Patojenik Leptospira tarafından biyofilm oluşumunda yer alan genlerin tanımlanmasına ilişkin gelecekteki çalışmalar, leptospirosis salgınına karşı daha ileri önleme yaklaşımlarını planlamak için son derece önemlidir.

    Bu çalışma, Malezya Yüksek Eğitim Bakanlığı tarafından Temel Araştırma Hibe Programı FRGS/STO3(02)/1209/2014(10) kapsamında finanse edilmiştir.

    Referanslar

    Adetunji, V.O. ve T.O. Isola, 2011. Yapışma E. koli ve E. koli O157: H7 ahşap, çelik ve cam yüzeylerde tipik bir tropikal mezbahadan izole edilir. Araş. J. Microbiol., 6: 669-677.
    ÇaprazRefDirect Bağlantısı

    Agarwal, R.K., S. Singh, K.N. Bhilegaonkar ve V.P. Singh, 2011. Farklı koşullarda biyofilm oluşturma yeteneğinin test edilmesi için mikrotitre plakası testinin optimizasyonu Salmonella serotipler. Int. Gıda Araş. J., 18: 1493-1498.
    Doğrudan bağlantı

    Aggarwal, S., P.S. Stewart ve R.M. Hozalski, 2015. Biyofilm yeniden kireçlenmesi için bir temel olarak biyofilm yapışma gücü: Bakteriyel biyofilmler gereğinden fazla mı tasarlanmış? Mikrobiyol. İçgörüler, 8: 29-32.
    ÇaprazRefDirect Bağlantısı

    Andrade, G.I. ve P.D. Brown, 2012. Leptospira sorgulayıcıları ve L. borgpetersenii memeli hücrelerine. FEMS İmmünol. Med. Mikrobiyol., 65: 105-115.
    ÇaprazRefDirect Bağlantısı

    Atzingen, M.V., G.M. Cerqueira, M.L. Vieira, R. Oliveira ve T.R. Oliveira ve diğerleri., 2015. Yeni Yapıştırıcıların Tanımlanması ve Karakterizasyonu leptospira. İçinde: Uygulamalı Mikrobiyoloji ve Mikrobiyal Biyoteknolojide Güncel Araştırma, Teknoloji ve Eğitim Konuları, Mendez-Vilas, A. (Eds). Formatex Araştırma Merkezi, İspanya, s: 704-713.

    Barbosa, A.Ş., P.A.E. Abreu, F.O. Neves, M.V. Atzingen ve M.M. Watanabe ve diğerleri., 2006. Yeni tanımlanan bir leptospiral adezin, laminin'e bağlanmaya aracılık eder. Bulaş. Bağışıklık., 74: 6356-6364.
    ÇaprazRefDirect Bağlantısı

    Berlanga, M., O. Domenech ve R. Guerrero, 2014. Polihidroksialkanoat biriktiren müstakil ve planktonik hücrelerde polistiren üzerinde biyofilm oluşumu Halomonas venusta. Int. Mikrobiyol., 17: 205-212.
    Doğrudan bağlantı

    Brihuega, B., L. Samartino, C. Auteri, A. Venzano ve K. Caimi, 2012. canlılarda yakın zamanda domuz biyofilmi oluşturan bir izolatın hücre agregasyonları Leptospira sorgulayıcıları Arjantin'den bir soy. Papaz Argent. Mikrobiyol., 44: 138-143.
    Doğrudan bağlantı

    Charyeva, O., J. Neilands, G. Svensater ve A. Wennerberg, 2015. Magnezyum implantları emen bakteriyel biyofilm oluşumu. J. Med'i açın. Mikrobiyol., 5:1-11.
    ÇaprazRefDirect Bağlantısı

    Cinco, M., 2010. Leptospirelerin patojenitesine dair yeni görüşler: Ev sahibi savunmalarından kaçınma. New Microbiol., 33: 283-292.
    PubMedDirect Bağlantısı

    De Souza, E.L., Q.G.S. Meira, IDM Barbosa, A.J.A.A. Athayde, M.L. Da Conceicao ve J.P. de Siqueira Junior, 2014. Biyofilm oluşumu stafilokok aureus et bazlı et suyunda gıda ile temas eden yüzeylerden ve dezenfektanlara duyarlılıktan. Braz. J. Microbiol., 45: 67-75.
    ÇaprazRefDirect Bağlantısı

    Evangelista, K.V. ve J. Coburn, 2010. Gelişmekte olan bir patojen olarak Leptospira: Biyolojisi, patogenezi ve konakçı bağışıklık tepkilerinin gözden geçirilmesi. Gelecek Mikrobiyol., 5: 1413-1425.
    CrossRefPubMedDirect Bağlantısı

    Garrett, T.R., M. Bhakoo ve Z. Zhang, 2008. Yüzeylerde bakteriyel yapışma ve biyofilmler. Prog. Nat. Bilim, 18: 1049-1056.
    ÇaprazRefDirect Bağlantısı

    Hu, Q., Y. Zhu, J. Tu, Y. Yin ve X. Wang ve diğerleri., 2012. Dahil olan genlerin tanımlanması Riemerella anatipestifer rastgele transpozon mutajenezi ile biyofilm oluşumu. PLoS ONE, Cilt. 7. 10.1371/journal.pone.0039805

    Koçzan, J.M., B.R. Lenneman, M.J. McGrath ve G.W. Sundin, 2011. Hücre yüzeyi bağlanma yapıları, biyofilm oluşumuna ve ksilem kolonizasyonuna katkıda bulunur. Erwinia amilovora. Uygulamalı Çevre. Mikrobiyol., 77: 7031-7039.
    ÇaprazRefDirect Bağlantısı

    Korres, A.M.N., G.M.D.F.V. Aquije, D.S. Buss, J.A. Ventura, P.M.B. Fernandes ve A.A.R. Fernandes, 2013. Bir fitopatolojik ve klinik izolatın biyofilm ve bağlanma mekanizmalarının karşılaştırılması Klebsiella pnömonisi subsp. pnömoni. Bilim. Dünya J. 10.1155/2013/925375

    Kumar, K.V., C. Lall, R.V. Raj, K. Vedhagiri ve P. Vijayachari, 2015. Patojenik leptospirelerin biyofilm oluşumuyla birlikte yaşaması ve hayatta kalması Azospirillum. FEMS Mikrobiyol. Ecol., Cilt. 91. 10.1093/femsec/fiv051

    Lee, H.Y., L.C. Çay, C.F. Pui, S. Mustafa, Y.K. Cheah, M. Nishibuchi ve S. Radu, 2013. Biyofilm oluşumu Listeria monocytogenes ATCC 19112, farklı inkübasyon sıcaklıklarında ve sodyum klorür konsantrasyonlarında. Braz. J. Microbiol., 44: 51-55.
    Doğrudan bağlantı

    Malamud, F., R.A. Homem, V.P. Confort, PM Yaryura ve AP Castagnaro ve diğerleri., 2013. Biyofilm oluşumu-kusurlu mutantların tanımlanması ve karakterizasyonu Xanthomonas citri subsp. limon. Mikrobiyoloji, 159: 1911-1919.
    ÇaprazRefDirect Bağlantısı

    Marinho, A.R., P.D. Martins, E.M. Ditmer, P.A. d'Azevedo, J. Frazzon, S.T. Van Der Sand ve A.P.G. Frazzon, 2013. Antibiyotiğe dirençli polistiren üzerinde farklı sıcaklıklarda biyofilm oluşumu enterokok faecalis ve enterokok faecium gıdalardan izole edilmiştir. Braz. J. Microbiol., 44: 423-426.
    ÇaprazRefDirect Bağlantısı

    Picardeau, M., D.M. Bulach, C. Bouchier, R.L. Zuerner ve N. Zidane ve diğerleri., 2008. Saprofitlerin genom dizisi Leptospira biflexa evrimi hakkında fikir verir leptospira ve leptospirosisin patogenezi. PLoS ONE, Cilt. 3. 10.1371/journal.pone.0001607

    Pui, C.F., L.M. Bilung, L. Su'ut ve K. Apun, 2015. Prevalence of leptospira Sarawak, Malezya'daki milli parklardan çevresel toprak ve sudaki türler. Borneo J. Kaynak. bilim Teknol., 5: 49-57.
    Doğrudan bağlantı

    Pui, C.F., L.M. Bilung, Y.L. Chong, L. Su'ut ve K. Apun, 2016. Detection of leptospira spp. Sarawak, Malezya'nın seçilmiş ulusal hizmet eğitim merkezlerinde ve çeltik tarlalarında polimeraz zincir reaksiyonu tekniği kullanılarak. J. Trop. Tarım. Bilim, (Baskıda).

    Ristow, P., P. Bourhy, S. Kerneis, C. Schmitt, M.C. Prevost, W. Lilenbaum ve M. Picardeau, 2008. Saprofitik ve patojenik leptospires tarafından biyofilm oluşumu. Mikrobiyoloji, 154: 1309-1317.
    ÇaprazRefDirect Bağlantısı

    Saxena, S., G. Banerjee, R. Garg ve M. Singh, 2014. Biyofilm oluşumunun karşılaştırmalı çalışması Pseudomonas aeruginosa Alt solunum yolu enfeksiyonu olan hastalardan elde edilen izolatlar. J. Clin. Teşhis Res., 8: DC09-DC11.
    ÇaprazRefDirect Bağlantısı

    Seixas, R., M. Gabriel, J. Machado, L. Tavares, F. Bernardo ve M. Oliveira, 2014. Simüle edilmiş gastrointestinal koşulların biyofilm oluşumu üzerindeki etkisi Salmonella 1,4,[5],12:i:-. Bilim. Dünya J. 10.1155/2014/153956

    Stepanovic, S., D. Vukovic, I. Dakic, B. Savic ve M. Svabic-Vlahovic, 2000. stafilokokal biyofilm oluşumu. J. Mikrobiyol. Yöntemler, 40:175-179.
    ÇaprazRefDirect Bağlantısı


    Patojenik Leptospira ile Biyofilm Oluşumunun Kantifikasyonu için Mikrotitre Plaka Testi

    Arka Plan ve Amaç: Biyofilm oluşumu bakteriyel patogenezin kurulması ve hastalık kontrolü için önemlidir. Hücre agregatlarının oluşumu, memeli bakım konağının renal tübüllerinin patojenik Leptospira tarafından uzun süreli kolonizasyonuna katkıda bulunmuştur. Bu çalışma, Sarawak, Malezya'daki sıçanlardan, toprak ve su örneklerinden izole edilen 29 patojenik Leptospira suşu arasındaki biyofilm oluşumunu ölçmeyi amaçladı. Malzemeler ve yöntemler: Orta üstel kültürlerden yaklaşık 106 bakteri mL ם'lik bir başlangıç ​​bakteri süspansiyonu inokulum hazırlandı. Biyofilm tahlili daha sonra 24 oyuklu mikrotitre plakalarında üç kopya halinde gerçekleştirildi. Elde edilen optik yoğunluğa dayalı olarak biyofilm oluşturma yeteneklerini değerlendirmek için kristal menekşe tahlili yapıldı. Yapışma kuvvetine göre, biyofilm oluşturma yetenekleri dört farklı kategoride sınıflandırıldı: yapışmayan, zayıf yapışan, orta derecede yapışan ve kuvvetli şekilde yapışan. Sonuçlar: Test edilen bakterilerin her birinin %32.26'sı 1. günde ya yapışmayan ya da zayıf yapışan biyofilm üreticileri olarak sınıflandırıldı. 2. günden 5. güne kadar çoğu, orta ve güçlü bir şekilde yapışık biyofilmler üretti. Tüm izolatlar 6. günden 10. güne kadar güçlü bir şekilde tutundu. En yüksek biyofilm üretimi 7. ila 8. günlerde fark edildi. Bu çalışmada, sıçanlar, toprak ve su örnekleri arasında en güçlü biyofilm üreticileri, OD 600 ile 8. günde 16.700'de ve artımn0.265'te P38, OD 600'de 21.760'ta ve artımn0.332'de ve 7.günde OD 600'de P22 ile 19.793±0'da P22'dir. 144, sırasıyla 7. günde. Çözüm: Sonuç olarak, test edilen tüm Leptospira, çeşitli çevresel habitatlarda hayatta kalmaya katkıda bulunan ve hastalık bulaşmasında beklenen güçlü biyofilm üretebildi.

    Chai Fung Pui, Kasing Apun, Jennifer Jalan, Lesley Maurice Bilung, Lela Su'ut ve Hashimatul Fatma Hashim, 2017. Patojenik Leptospira Tarafından Biyofilm Oluşumunun Nicelenmesi için Mikrotitre Plaka Testi. Araştırma Mikrobiyoloji Dergisi, 12: 146-153.

    Doğada, mikroorganizmalar dahil patojenik bakteri planktonik kültürler olarak toplu çözeltide nadiren serbestçe bulunurlar. Bunun yerine, biyofilm 1,2 oluşturan bir yüzeye bağlı bir birim olarak var olmaya eğilimlidirler. Biyofilm, insan diş yüzeylerinden 3 kazıdığı "Hayvanlar" kümelerinin mikroskop altında gözlemlendi. O zamandan beri, biyofilm, bir alt tabakaya veya birbirine geri döndürülemez bir şekilde bağlı olan ve Hücre Dışı Polimerik Maddelerin (EPS) 4,5 kendi ürettiği yapışkan matrisine gömülü olan bakterilerin sapsız topluluğu olarak tanımlanmıştır.

    Bakteriyel yapışma, biyofilm oluşumu 6 sürecindeki ilk adımdır. Uygun koşullar altında hemen hemen tüm bakteri türleri biyotik (hayvan ve bitki dokuları) ve abiyotik (plastik, cam, metal, ahşap) yüzeylere yapışabilir 7,8 . Hem patojenik hem de saprofitik Leptospira'nın ayakta duran kültürlerde 9 yüzeyle ilişkili biyofilmler oluşturduğu bildirilmiştir. Picardeau ve ark. 10, L. interrogans ve L. biflexa tarafından katı yüzeylerde güçlü biyofilm üretildiğini belirtmiştir.

    Leptospira spp'nin yapışması. hücreleri barındırmak için leptospirosis enfeksiyon 11 için ilk adım olarak gereklidir. Aşınma yoluyla konakçıya nüfuz ettikten sonra, patojenik Leptospira, kanda çoğaldıkça ve endotelyal ve epitelyal hücrelere yapışırken hedef organları verimli bir şekilde kolonize eder. Öte yandan, saprofitik Leptospira, fagositoz 12 ile kan dolaşımından hızla temizlenir. Biyofilm oluşumu patojenik Leptospira'nın renal tübüllerde kolonize olmasını kolaylaştırırken, saprofitik Leptospira'nın su gibi belirli çevresel nişleri işgal etmesini kolaylaştırır 10.

    Farklı hayvan konakçılarında ve çevrelerinde patojenik Leptospira ile ilgili çeşitli prevalans çalışmaları dünya çapında rapor edilmiştir. Daha önceki çalışmalarımızda Leptospira spp. Sarawak, Malezya'daki milli parklardan gelen çevresel toprak ve su 13 ve ayrıca Leptospira spp. Sarawak, Malezya 14 . Patojenik Leptospira'nın mevcudiyeti, biyofilm oluşturma yetenekleriyle kolaylaştırılabilen konakçı ve çevredeki adaptasyonlarını ifade eder. Bu nedenle, bu çalışma, mikrotiter plaka testi kullanılarak önceki çalışmalardan elde edilen patojenik Leptospira izolatlarında biyofilm oluşumunu değerlendirmeyi amaçlamıştır. İzolatlar ayrıca biyofilm oluşturma yeteneklerine göre farklı kategorilere ayrıldı.

    Bakteriyel izolatlar ve büyüme durumu: Universiti Malaysia Sarawak, Kaynak Bilimi ve Teknoloji Fakültesi, Moleküler Biyoloji Bölümü, Mikrobiyoloji Laboratuvarı'ndan toplam 29 patojenik Leptospira izolatı elde edildi. İzolatların detayları Tablo 1'de verilmiştir. Leptospira noguchii ve L. interrogans, pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Tüm kültürler, 100 µm mL ם 5-florourasil ile modifiye edilmiş yarı katı Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH) et suyunda oda sıcaklığında tutuldu.

    Başlangıç ​​bakteri süspansiyonunun hazırlanması: Orta üstel kültür, stok kültürünün modifiye edilmiş yarı katı EMJH broth içinde 1 hafta süreyle inkübe edilmesiyle hazırlandı. Daha sonra spektrofotometre (Metertech Inc.) kullanılarak 420 nm'de yaklaşık 0.3-0.4 optik yoğunluğa standartlaştırıldı ve bu da yaklaşık 108 bakteri mL ם'e karşılık geldi. Daha sonra bu orta üstel kültürden 15 106 bakteri mL'lik bir başlangıç ​​bakteri süspansiyonu aşısı hazırlandı.

    Mikrotitre plakası biyofilm tahlili: Biyofilm tahlili, 24 oyuklu mikrotitre plakalarında üç kopya halinde gerçekleştirildi ( doku kültürü işlenmiş, düz tabanlı kuyular TPP). EMJH suyu, negatif kontrol olarak kullanıldı. Mikrotitre plakası biyofilm tahlilini gerçekleştirme prosedürü Ristow ve ark. 9 ve Lee ve diğerleri. 16 .

    Kısaca, 10 gün boyunca her gün 24 saatlik zaman aralığı ile sıvı kültür çıkarıldı. Yapışmayan planktonik hücreyi uzaklaştırmak için kuyucuklar distile su ile nazikçe yıkandı. Daha sonra, %2 sodyum asetat kullanılarak fiksasyondan önce 15 dakika boyunca havada kurumaya bırakıldı. Sodyum asetat solüsyonu çıkarıldı ve tekrar havada kurumaya bırakıldı. Hücreler, 20 dakika boyunca 900 &uL %1 kristal viyole solüsyonu kullanılarak boyandı, ardından kristal menekşe solüsyonu çıkarıldı. Hücreler daha sonra üç kez distile su ile yıkandı. Son olarak, oyuklarda kalan kristal menekşe, 600 nm'de (OD600) optik yoğunluk ölçümünden önce 1 mL etanol/aseton (80/20 v/v solüsyon) içinde çözündürüldü. Kristal morun arka plan boyamasını düzeltmek için, negatif kontrolün 600 nm'sindeki ortalama optik yoğunluk, patojenik Leptospira tarafından biyofilm oluşumunun 600 nm'deki ortalama optik yoğunluğundan çıkarıldı. Sonuçlar ortalama&artı standart sapma olarak sunuldu.

    Biyofilm oluşturma yeteneğinin izolatlara göre sınıflandırılması: Leptospira'nın biyofilm oluşturma yeteneği Stepanovic ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi belirlendi. 17, Marinho ve diğerleri. 7 ve Saxena ve ark. 18. 29 patojenik Leptospira izolatının biyofilm oluşturma yetenekleri ve her gün pozitif kontroller, elde edilen optik yoğunluğa göre dört kategoride sınıflandırıldı. Optik yoğunluk sınır değeri (ODc), negatif kontrolün ortalama optik yoğunluğunun (OD) üzerindeki üç standart sapma olarak tanımlanır.

    Bu dört kategori, OD

    İstatistiksel analiz: İstatistiksel analiz, SPSS sürüm 20.0 yazılımı (IBM Corporation, NY, ABD) kullanılarak yapıldı. Değişkenler için ortalamalar arasındaki farklar, tekrarlanan ölçümler ANOVA kullanılarak değerlendirildi. Biyofilm OD 600 ortalama değerlerini karşılaştırmak için post hoc Bonferroni testi kullanıldı.Anlamlılık düzeyi p<0.05 olarak belirlendi.

    Bu çalışmada, 10 inkübasyon günü boyunca test edilen tüm Leptospira izolatları için mikrotitre plakası biyofilm testi kullanılarak biyofilm oluşumu Şekil 1, 2 ve 3'te gösterilmektedir. Verilerin güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için testler üç kopya halinde gerçekleştirildi. İstatistiksel analiz, bu bakterilerin biyofilm oluşumunda zamanın etkisinde önemli bir fark olduğunu göstermiştir (p<0.05). Bu bakterilerin de biyofilm oluşturmada kendi aralarında istatistiksel olarak anlamlı farklılık gösterdiği bulundu (p<0.05).

    Şekil 1, 2 ve 3'e dayanarak, test edilen tüm Leptospira izolatlarının biyofilm büyümesi üzerinde benzer bir model gösterdiği gözlemlendi. 1. ve 2. günde, OD600 ile gösterildiği gibi oluşan biyofilm miktarı hala düşüktü. Miktar, yapışan bakteri sayısındaki artışı gösteren 3. günden itibaren artmaya başlar. Ortalama olarak, en yüksek biyofilm OD 600 ortalama değerleri 7. veya 8. günde elde edilmiştir, bakteriler arasında değişmektedir. En yüksek noktaya ulaştıktan sonra biyofilm OD 600 ortalama değerlerinde bir düşüş oldu. Her gün farklı biyofilm oluşturma yeteneklerine sahip test edilen bakteri sayısı Tablo 2'de gösterilmektedir. İncelenen 29 patojenik Leptospira izolatı ve 2 pozitif kontrol arasında, her biri %32.26'sı 1. günde yapışmayan veya zayıf yapışan biyofilm üreticileri olarak sınıflandırıldı. Çoğunluğu 2. günden 5. güne kadar orta derecede ve güçlü bir şekilde yapışan biyofilmler üretti. Hepsi 6. günden itibaren güçlü bir şekilde yapışma yetenekleri elde ettiler ve 10. güne kadar güçlü bir şekilde bağlı kaldılar.

    Mikrotitre plakası biyofilm testi kullanılarak değerlendirilen biyofilm üretimi, 6. günün sonucunda gösterildiği gibi bu çalışmada %100 güçlü biyofilm üreticileri ortaya çıkardı. Sıçan izolatları arasında en güçlü biyofilm üreticisi, 8. günde OD 600 ile 16.700±0.265 ile P38'dir. İncelenen 14 toprak örneğinden P18, 7. günde 21.760±0.332 OD 600 ile en güçlü biyofilm üreticisidir.

    Su numuneleri için P22'nin 7. günde 19.793±0.144 OD 600 ile en güçlü biyofilm üreticisi olduğu bilinmektedir. Post hoc Bonferroni testi, ikili karşılaştırmalar yapıldığında bu üç izolatın (P18, P22 ve P38) birbirinden istatistiksel olarak farklı olduğunu ve biyofilm oluşumunda pozitif kontroller olduğunu gösterdi (p<0.05).

    Bakteriler tarafından biyofilm oluşumu genellikle farklı bağlanma (tersinir ve tersinmez), büyüme ve ayrılma 1 aşamaları ile karakterize edilir. Bu çalışmada, patojenik Leptospira izolatlarının, diğer bakterilere farklı süreç taklitleri yoluyla biyofilm geliştirdiği bulunmuştur. Sonuç, 29 patojenik Leptospira izolatının ve pozitif kontrollerin tümü için 24 oyuklu mikrotitre plakalarının dibinde biyokütle oluştuğunu gösterdi. İşlem, Leptospira hücrelerinin 24 oyuklu mikrotitre plakalarının yüzeyine ulaşması ve bağlanmasıyla başladı. Hücre yapışmasının ardından, yüzey algılama tepkileri geliştirdiler ve çevredeki besinleri ve sıvıları 16,1 hapseden şartlandırma filmine yapıştılar.

    1-6 gün arasında, bağlı hücreler mikrokoloniler oluşturdular ve ekzopolisakkarit matriksinin mevcudiyeti ile bir arada tutuldular. Bu matris, hücreleri stresli çevresel koşullardan 19 koruyan hücre dışı DNA, proteinler ve ölü hücre kalıntıları içeriyordu. Bu mikrokoloniler 7. ve 8. günlerde üç boyutlu yapılara sahip makrokoloniler olarak olgunlaşana kadar genişledi ve çoğaldı.

    Olgunlaşmadan sonra, makrokoloniler içindeki bakteriler dağıldı ve ya planktonik kültürler olarak hayatta kaldı ya da ölmeye başladı. Sonuç olarak, bu çalışmada patojenik Leptospira tarafından biyofilm oluşumu süreci dinamik ve genetik olarak düzenlenmiş bir süreç olarak düşünülebilir. Bu, Hu ve arkadaşlarının önceki çalışmasına uygundu. 20 farklı bakteri türlerinin benzer süreçlerle biyofilm ürettiğini gözlemleyerek biyofilm oluşumunun genetik olarak düzenlenmiş bir süreç olduğunu öne sürmüştür. Benzer bir gözlem Sun ve ark. 21 biyofilm oluşumunun stafilokok aureus dinamik bir süreçtir.

    Biyofilm oluşumunun belirlenmesi farklı yöntemler kullanılarak değerlendirilmiştir, ancak farklı bakteri türlerinin biyofilm oluşturma yeteneğini belirlemek için standart bir protokol oluşturulmamıştır. Örneğin, bir kültür tüpünü kaplayan bakteri filmi genellikle katyonik bir boya ile boyanır ve tüp test yönteminde görsel olarak ölçeklenir. Bu yöntem niteldir ve bu nedenle sonuç yorumunda özneldir 17 . Bu çalışmada, lekeli Leptospira biyofilminin optik yoğunluğunun spektrofotometrik olarak belirlendiği mikrotitre plaka testi seçilmiştir.

    Mikrotiter plaka tahlili, yalnızca kuyunun dibinde biyofilm tespitinin büyük dezavantajından muzdarip olsa da, bu tahlil, biyofilm niceleme 22,18'de en sık kullanılan yöntem olarak kabul edilir. Mikrotiter plaka testinden elde edilen optik yoğunluk ölçümü, elde edilen sonuçların yorumlanmasında tüp testinin sübjektifliğini ortadan kaldırır ve klinik uygunluğu tüp testinden 17 daha güvenilir şekilde tahmin eder. Ayrıca, bu çalışmada kullanılan kristal viyole, resazurin veya dimetil metilen mavisi gibi farklı boyaların uygulanması, kantitatif biyofilm ölçümü 23 sağladığında, mikrotitre plaka testinin yapılması kolaydır.

    Bu çalışmada, kristal viyole boyama ile gösterilen biyofilm miktarı, 7. ve 8. günlerde yaklaşık 12 olan maksimum OD 600 ortalama değerlerine ulaşmak için zamana bağlı bir şekilde arttı. Bu değer Ristow ve diğerleri tarafından yapılan çalışmanın aksinedir. Bir saprofit olan Leptospira biflexa için 2 günlük inkübasyonun ardından kristal viyole boyamanın ardından yaklaşık 2 olan maksimum OD 600 ortalama değerlerini bildiren 9 kişi.

    En yüksek biyofilm hücre doygunluğunda (7. ve 8. gün), patojenik Leptospira için absorbans değeri, saprofitik Leptospira 9'dan yaklaşık 6 kat daha yüksekti. Bu nedenle, patojenik Leptospira'nın saprofitik Leptospira'dan önemli ölçüde daha yüksek biyofilm oluşumu ürettiği sonucuna varıldı. Brihuega ve arkadaşları tarafından daha önceki bir çalışmada. 24, L. interrogans serovar Pomona ve L. biflexa serovar Patoc domuz izolatının biyofilm oluşumunu değerlendirmek için, patojenik suşun, 5. günde saprofitik suşa kıyasla daha kalın bir biyofilm tabakası geliştirdiği bulundu. Ayrıca L. interrogans'ın Azospirillum brasilense hücreleri ile bir arada bulunması yoğun bir biyofilm tabakası oluşturmuş ve burada 2. günde 25 lamlarda maksimum hücre aderansına ulaşmışlardır.

    Patojenik ve saprofitik Leptospira'nın biyofilm oluşumundaki farklı yeteneklerini destekleyen bir başka neden de, patojenik Leptospira'da tanımlanmış ancak saprofitik Leptospira'da olmayan bazı kolonizasyon faktörlerinin keşfedilmesidir. Bu, ilk enfeksiyona katkıda bulunan farklı adezinlere atfedilebilir. L. interrogans serovar Icterohaemorrhagiae'nin dış kılıfından izole edilen 36 kDa fibronektin bağlayıcı proteinin sadece patojenik suşlarda 12,26 bulunduğu bilinmektedir.

    Patojenik Leptospira izolatları için OD 600 ortalama değerlerinin 8. ve 9. günlerde düştüğü fark edildi. Charyeva ve arkadaşlarının önceki çalışması. 27, Staphylococcus epidermidis tarafından üretilen biyofilmin 3 ila 7 gün arasında azaldığını ortaya koydu. Ristow ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışmada. 9 , saprofitik Leptospira izolatları için OD 600 ortalama değerlerinin 3. günde düştüğünü belirtmişlerdir. Böylece, bu, patojenik Leptospira'nın biyofilm üretme yeteneğini saprofitik Leptospira'dan daha iyi sürdürebileceğini gösterdi. Biyofilmi sürdürme yeteneğinin, Leptospira suşları tarafından enfeksiyona etkisi olabilir. Mukoza zarına veya aşınmış cilde maruz kaldıktan sonra, patojenik Leptospira, doku bariyerlerini ve kan istilasını geçerek hızla sistemik enfeksiyon oluşturur. Kollajen tip I, tip IV, laminin ve fibronektin 28 gibi hücre dışı matris bileşenlerine yapışırlar. Atzingen ve ark. 29 hücre dışı matrikse bağlanmanın virülans ile ilişkili olduğunu, çünkü hücre dışı matrikse bağlanmanın patojenik Leptospira'da orta ve saprofitik Leptospira'dan daha etkili olduğunu belirtti.

    Biyofilm üretim miktarındaki değişkenlik, bu çalışmada gösterildiği gibi, patojenik Leptospira'dan farklı izolatlar farklı yapışma yeteneklerinde biyofilm ürettiği için yaygındır. Bununla birlikte, Stepanovic ve diğerleri tarafından kullanılan sınıflandırmaya dayanmaktadır. 17'de izolatların tümü, mikrotitre plakaları üzerinde güçlü biyofilm oluşturan güçlü biyofilm üreticileri olarak kabul edilir. Patojenik Leptospira'daki güçlü biyofilm üretimi, çeşitli ortamlarda hayatta kalmak için önemli bir faktördür. Leptospirosis yaygın olarak patojenik Leptospira'dan kaynaklandığından, bu daha sonra dolaylı olarak Leptospira patogenezine katkıda bulunacaktır. Bu Hu ve ark. Bakteriler tarafından biyofilm oluşumunun birçok bakteriyel enfeksiyonun patogenezinde önemli olduğundan bahseden 20. Tüm insan bakteriyel enfeksiyonlarının %60'ından fazlası, ilgili bakteriler 30 tarafından biyofilm oluşumunun kalıcılığına bağlanmıştır. Bakteri patojenleri, konukçu kurulmasına, popülasyonun genişlemesine ve en önemlisi hastalık proliferasyonuna 31 yardımcı olmak için biyofilm gelişimine güvenebilir.

    Bu çalışmada, patojenik Leptospira izolatları arasında biyofilm oluşturma yeteneklerini değerlendirmek için basit bir biyofilm ölçümü yöntemi olan mikrotitre plakası biyofilm tahlili başarıyla kullanılmıştır. Genel olarak, bu çalışmada incelenen 29 Leptospira izolatı, güçlü biyofilm üretme yeteneğine sahiptir, ancak oluşan biyofilm miktarı izolattan izolata farklıydı. Biyofilmin insan enfeksiyonunun patogenezindeki rolü inkar edilemez. Biyofilm oluşumu tıp alanında, halk sağlığında, endüstride ve çevrede ciddi sonuçlara yol açabilmektedir. Patojenik Leptospira tarafından biyofilm oluşumunda yer alan genlerin tanımlanmasına ilişkin gelecekteki çalışmalar, leptospirosis salgınına karşı daha ileri önleme yaklaşımlarını planlamak için son derece önemlidir.

    Bu çalışma, Malezya Yüksek Eğitim Bakanlığı tarafından Temel Araştırma Hibe Programı FRGS/STO3(02)/1209/2014(10) kapsamında finanse edilmiştir.

    2: De Souza, E.L., Q.G.S. Meira, IDM Barbosa, A.J.A.A. Athayde, M.L. Da Conceicao ve J.P. de Siqueira Junior, 2014. Biyofilm oluşumu stafilokok aureus et bazlı et suyunda gıda ile temas eden yüzeylerden ve dezenfektanlara duyarlılıktan. Braz. J. Microbiol., 45: 67-75.
    Çapraz Referans | Doğrudan Bağlantı |

    3: Garrett, T.R., M. Bhakoo ve Z. Zhang, 2008. Yüzeylerde bakteriyel yapışma ve biyofilmler. Prog. Nat. Bilim, 18: 1049-1056.
    Çapraz Referans | Doğrudan Bağlantı |

    4: Korres, A.M.N., G.M.D.F.V. Aquije, D.S. Buss, J.A. Ventura, P.M.B. Fernandes ve A.A.R. Fernandes, 2013. Bir fitopatolojik ve klinik izolatın biyofilm ve bağlanma mekanizmalarının karşılaştırılması Klebsiella pnömonisi subsp. pnömoni. Bilim. Dünya J. 10.1155/2013/925375

    5: Aggarwal, S., P.S. Stewart ve R.M. Hozalski, 2015. Biyofilm yeniden kireçlenmesi için bir temel olarak biyofilm yapışma gücü: Bakteriyel biyofilmler gereğinden fazla mı tasarlanmış? Mikrobiyol. İçgörüler, 8: 29-32.
    Çapraz Referans | Doğrudan Bağlantı |

    6: Adetunji, V.O. ve T.O. Isola, 2011. Yapışma E. koli ve E. koli O157: H7 ahşap, çelik ve cam yüzeylerde tipik bir tropikal mezbahadan izole edilir. Araş. J. Microbiol., 6: 669-677.
    Çapraz Referans | Doğrudan Bağlantı |

    7: Marinho, A.R., P.D. Martins, E.M. Ditmer, P.A. d'Azevedo, J. Frazzon, S.T. Van Der Sand ve A.P.G. Frazzon, 2013. Antibiyotiğe dirençli polistiren üzerinde farklı sıcaklıklarda biyofilm oluşumu enterokok faecalis ve enterokok faecium gıdalardan izole edilmiştir. Braz. J. Microbiol., 44: 423-426.
    Çapraz Referans | Doğrudan Bağlantı |

    8: Zameer, F., M.S. Rukmangada, J.B. Chauhan, S.A. Khanum ve P. Kumar ve diğerleri., 2016. Yapışkan ve yapışma önleyici özelliklerinin değerlendirilmesi Pseudomonas aeruginosa biyofilmler ve bunların bitkisel bitkiler tarafından inhibisyonu. İran. J. Microbiol., 8: 108-119.
    Doğrudan Bağlantı |

    9: Ristow, P., P. Bourhy, S. Kerneis, C. Schmitt, M.C. Prevost, W. Lilenbaum ve M. Picardeau, 2008. Saprofitik ve patojenik leptospires tarafından biyofilm oluşumu. Mikrobiyoloji, 154: 1309-1317.
    Çapraz Referans | Doğrudan Bağlantı |

    10: Picardeau, M., D.M. Bulach, C. Bouchier, R.L. Zuerner ve N. Zidane ve diğerleri., 2008. Saprofitlerin genom dizisi Leptospira biflexa evrimi hakkında fikir verir leptospira ve leptospirosisin patogenezi. PLoS ONE, Cilt. 3. 10.1371/journal.pone.0001607

    11: Evangelista, K.V. ve J. Coburn, 2010. Gelişmekte olan bir patojen olarak Leptospira: Biyolojisi, patogenezi ve konakçı bağışıklık tepkilerinin gözden geçirilmesi. Gelecek Mikrobiyol., 5: 1413-1425.
    Çapraz Referans | PubMed | Doğrudan Bağlantı |

    12: Barbosa, A.Ş., P.A.E. Abreu, F.O. Neves, M.V. Atzingen ve M.M. Watanabe ve diğerleri., 2006. Yeni tanımlanan bir leptospiral adezin, laminin'e bağlanmaya aracılık eder. Bulaş. Bağışıklık., 74: 6356-6364.
    Çapraz Referans | Doğrudan Bağlantı |

    13: Pui, C.F., L.M. Bilung, L. Su'ut ve K. Apun, 2015. Prevalence of leptospira Sarawak, Malezya'daki milli parklardan çevresel toprak ve sudaki türler. Borneo J. Kaynak. bilim Teknol., 5: 49-57.
    Doğrudan Bağlantı |

    14: Pui, C.F., L.M. Bilung, Y.L. Chong, L. Su'ut ve K. Apun, 2016. Detection of leptospira spp. Sarawak, Malezya'nın seçilmiş ulusal hizmet eğitim merkezlerinde ve çeltik tarlalarında polimeraz zincir reaksiyonu tekniği kullanılarak. J. Trop. Tarım. Bilim, (Baskıda).

    15: Wuthiekanun, V., P. Amornchai, D.H. Paris, S. Langla ve J. Thaipadunpanit ve diğerleri., 2013. Hızlı izolasyon ve duyarlılık testleri leptospira spp. yeni bir katı ortam, LVW agar kullanarak. Antimikrobiyal. Ajanlar Chemother., 57: 297-302.
    Çapraz Referans | Doğrudan Bağlantı |

    16: Lee, H.Y., L.C. Çay, C.F. Pui, S. Mustafa, Y.K. Cheah, M. Nishibuchi ve S. Radu, 2013. Biyofilm oluşumu Listeria monocytogenes ATCC 19112, farklı inkübasyon sıcaklıklarında ve sodyum klorür konsantrasyonlarında. Braz. J. Microbiol., 44: 51-55.
    Doğrudan Bağlantı |

    17: Stepanovic, S., D. Vukovic, I. Dakic, B. Savic ve M. Svabic-Vlahovic, 2000. stafilokokal biyofilm oluşumu. J. Mikrobiyol. Yöntemler, 40:175-179.
    Çapraz Referans | Doğrudan Bağlantı |

    18: Saxena, S., G. Banerjee, R. Garg ve M. Singh, 2014. Biyofilm oluşumunun karşılaştırmalı çalışması Pseudomonas aeruginosa Alt solunum yolu enfeksiyonu olan hastalardan elde edilen izolatlar. J. Clin. Teşhis Res., 8: DC09-DC11.
    Çapraz Referans | Doğrudan Bağlantı |

    19: Malamud, F., R.A. Homem, V.P. Confort, PM Yaryura ve AP Castagnaro ve diğerleri., 2013. Biyofilm oluşumu-kusurlu mutantların tanımlanması ve karakterizasyonu Xanthomonas citri subsp. limon. Mikrobiyoloji, 159: 1911-1919.
    Çapraz Referans | Doğrudan Bağlantı |

    20: Hu, Q., Y. Zhu, J. Tu, Y. Yin ve X. Wang ve diğerleri., 2012. Dahil olan genlerin tanımlanması Riemerella anatipestifer rastgele transpozon mutajenezi ile biyofilm oluşumu. PLoS ONE, Cilt. 7. 10.1371/journal.pone.0039805

    21: Sun, J.L., S.K. Zhang, X.X. Chen, J.Y. Chen ve B.Z. Han, 2012. Büyüme özellikleri stafilokok aureus polistiren plaka üzerinde oluşturulan biyofilmde. Afr. J. Mikrobiyol. Araş., 6: 3284-3291.
    Doğrudan Bağlantı |

    22: Agarwal, R.K., S. Singh, K.N. Bhilegaonkar ve V.P. Singh, 2011. Farklı koşullarda biyofilm oluşturma yeteneğinin test edilmesi için mikrotitre plakası testinin optimizasyonu Salmonella serotipler. Int. Gıda Araş. J., 18: 1493-1498.
    Doğrudan Bağlantı |

    23: Seixas, R., M. Gabriel, J. Machado, L. Tavares, F. Bernardo ve M. Oliveira, 2014. Simüle edilmiş gastrointestinal koşulların biyofilm oluşumu üzerindeki etkisi Salmonella 1,4,[5],12:i:-. Bilim. Dünya J. 10.1155/2014/153956

    24: Brihuega, B., L. Samartino, C. Auteri, A. Venzano ve K. Caimi, 2012. canlılarda yakın zamanda domuz biyofilmi oluşturan bir izolatın hücre agregasyonları Leptospira sorgulayıcıları Arjantin'den bir soy. Papaz Argent. Mikrobiyol., 44: 138-143.
    Doğrudan Bağlantı |

    25: Kumar, K.V., C. Lall, R.V. Raj, K. Vedhagiri ve P. Vijayachari, 2015. Patojenik leptospirelerin biyofilm oluşumuyla birlikte yaşaması ve hayatta kalması Azospirillum. FEMS Mikrobiyol. Ecol., Cilt. 91. 10.1093/femsec/fiv051

    26: Andrade, G.I. ve P.D. Brown, 2012. Leptospira sorgulayıcıları ve L. borgpetersenii memeli hücrelerine. FEMS İmmünol. Med. Mikrobiyol., 65: 105-115.
    Çapraz Referans | Doğrudan Bağlantı |

    27: Charyeva, O., J. Neilands, G. Svensater ve A. Wennerberg, 2015. Magnezyum implantları emen bakteriyel biyofilm oluşumu. J. Med'i açın. Mikrobiyol., 5:1-11.
    Çapraz Referans | Doğrudan Bağlantı |

    28: Cinco, M., 2010. Leptospirelerin patojenitesine dair yeni görüşler: Ev sahibi savunmalarından kaçınma. New Microbiol., 33: 283-292.
    PubMed | Doğrudan Bağlantı |


    Malzemeler ve yöntemler

    Hücre Hatları, Virüs Enfeksiyonu ve Bakteriyel Suşlar.

    Ölümsüzleştirilmiş insan CF bronş epitel hücre hattı CFBE41o- (burada "AEC'ler" olarak anılacaktır) bir ΔF508/ΔF508 hastasından izole edildi, Transwell filtrelerinde kültürlendi ve 7-10 gün süreyle hava-sıvı arayüzünde büyütüldü. Birincil HBE hücreleri (ref. 19'da açıklandığı gibi Pittsburgh Üniversitesi'ndeki Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanan protokol kapsamında bilgilendirilmiş onam ile) CF hastalarının eksplante edilmiş akciğerlerinden elde edildi ve hava-sıvı koşulları altında Transwell eklerinde kültürlendi. 72 saat boyunca RSV [tohumlanmış hücrelerin enfeksiyon çokluğu (MOI) = 1], hrV14 (MOI = 1) veya insan Ad5 (MOI = 1) saflaştırılmış insan A2 suşu ile enfekte. NS P. aeruginosa yapısal olarak GFP'yi eksprese eden PAO1 suşu, daha önce tarif edildiği gibi kullanıldı (19, 40).

    Kokültür Biyofilm Deneyleri.

    Canlı hücre görüntüleme, refs'de açıklandığı gibi virüs enfeksiyonu varlığında veya yokluğunda epitel hücreleri üzerinde büyütülen bakteriyel biyofilmleri görüntülemek için kullanıldı. 18, 19 ve 40). P. aeruginosa statik ortak kültür biyofilm deneyleri daha önce tarif edildiği gibi yapıldı (19, 40).

    Demir Analizi.

    CM, AEC'lerden toplandı, hücre kalıntıları 1400 x santrifüjleme ile çıkarıldı Gve CM, 4 °C'de saklandı. CM cinsinden toplam demir, QuantiChrom Iron Assay Kit (BioAssay Systems) kullanılarak ölçülmüştür.

    In Vivo RSV Enfeksiyon Çalışmaları.

    In vivo RSV enfeksiyon çalışmaları, NIH'deki tavsiyelere sıkı sıkıya uygun olarak yürütülmüştür. Laboratuvar Hayvanlarının Bakım ve Kullanım Kılavuzu (48) ve Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır (protokol numarası 14023340). Fareler, IACUC yönergelerine göre ele alındı ​​ve hayvanların acı çekmesini en aza indirmek için tüm çabalar gösterildi. Fareler, Pittsburgh Üniversitesi Laboratuvar Hayvan Kaynakları Bölümünde barındırıldı. BALB/cJ farelerinden elde edilen yenidoğan fareler (yavrular), daha önce tarif edildiği gibi (28), 5 x 105 pfu/g vücut ağırlığı RSV hattı 19 veya PBS ile intranazal olarak aşılandı (28).BALF, demir tahlili ile analiz için toplandı ve transferrin bolluğu Western blot ile değerlendirildi.

    İstatistiksel analiz.

    İstatistiksel analiz için GraphPad Prism versiyon 6.0 (GraphPad) kullanıldı. Ortalamalar Student kullanılarak karşılaştırıldı T test edin veya çoklu karşılaştırmalar için Tukey'nin post hoc testi ile ANOVA. P <0.05 anlamlı kabul edildi.

    Ek yöntemler şurada bulunabilir: SI Materyalleri ve Yöntemleri.


    Sonuçlar

    Saf kültür biyofilm oluşumu

    Biyofilm oluşturma yeteneği, Tablo 1'de sunulan bakteriler için bir kristal mor mikrotitre plaka tahlili kullanılarak araştırıldı. Üç takson, dört kültür ortamının hepsinde biyofilm oluşturabildi, yani Acinetobacter calcoaceticus, Comamonas denitrificans 123 ve Pseudomonas aeruginosa (Şekil 1). 13 organizmanın tümü en az bir ortamda biyofilm oluşturabildi. Biyofilm oluşumu, sekiz suşun güçlü biyofilm oluşturduğu asetat ortamında en tutarlı şekilde elde edildi. Atık su ve glikoz istatistiksel olarak eşit sonuçlar verdi (P=1), oysa dNB daha zayıf biyofilm oluşumuna neden oldu (P<0.05). Glikoz ortamında en güçlü planktonik büyüme gözlendi, bunu asetat izledi. Atık su ve dNB büyümesi önemli ölçüde daha düşüktü (P=0.001, veriler gösterilmemiştir). Kültür süresi (24 veya 48 saat) biyofilm oluşumunu etkilemedi (P=0.8), bunun dışında Zoogloea ramigera biyofilm oluşumunun 24 saatte güçlüden 48 saatte sıfıra düştüğü asetat ortamında.

    Atık su, asetat ortamı, glikoz ortamı ve seyreltilmiş besin suyu (dNB) içindeki saf kültürler için biyofilm oluşturma deneyinden elde edilen sonuç. Alt noktalı çizginin altındaki çubuklar biyofilm oluşturucu değildir, üst noktalı çizginin üzerindeki çubuklar güçlü biyofilm oluşturucular olarak kabul edilir. Çubuklar, SD'lerle ortalama değerleri temsil eder (n=24).

    Atık su, asetat ortamı, glikoz ortamı ve seyreltilmiş besin suyu (dNB) içindeki saf kültürler için biyofilm oluşturma deneyinden elde edilen sonuç. Alt noktalı çizginin altındaki çubuklar biyofilm oluşturucu değildir, üst noktalı çizginin üzerindeki çubuklar güçlü biyofilm oluşturucular olarak kabul edilir. Çubuklar, SD'lerle ortalama değerleri temsil eder (n=24).

    Fizyolojik özellikler

    Tablo 1'de listelenen bakteriler için biyofilm oluşumu için başlangıç ​​yapışması, hidrofobiklik, amiloid üretimi ve EPS üretiminin önemi araştırıldı. Comamonas denitrificans 110 ve Brachymonas denitrificans B79, ilk yapışma testine göre polistiren yüzeylere (sırasıyla %15.1 ve %13.5) en kolay şekilde yapışmıştır ( Tablo 2). Bacillus cereus SJV, Z. ramigera, B. denitrificans SJV ve Klebsiella pnömoni SJV, zayıf yapışma özellikleri gösterdi (<%1). Bir tek Acinetobacter calcoaceticus ve B. denitrificans B79, hidrofobik hücre yüzeyi özelliklerine (>%70) sahipti ve ikiden fazla organizmaya sahip değildi, B. cereus SJV ve B. denitrificans B79, Kongo kırmızısı bağlayıcı amiloid adezinleri üretti ( Tablo 2). FISH-CLSM, biyofilmlerin C. denitrificans 110 ve 123 suşları ve B. cereus SJV, EPS ile çevrili dağınık hücre kümeleri oluştururken A. kalkoasetikus çok az veya hiç EPS'si olmayan tek tip bir hücre matı üretti. Brachymonas denitrificans B79 ve P. aeruginosa aynı zamanda tek tip hücre matları oluşturdu, ancak biyofilmin çok katmanlı bölümlerinde orta derecede EPS varlığı ile. Şekil 2, farklı biyofilm morfolojilerini göstermektedir. C. denitrificans 110 ve A. kalkoasetikus. Saf kültürlerin biyofilm kalınlığı, tüm organizmalar için birkaç hücre katmanına karşılık gelen 9-21 μm idi.

    Planktonik büyüme, fizyolojik hücre özellikleri ve mikroskobik gözlemler

    Türler Planktonik büyüme, 24 saat (OD620 nm) İlk bağlılık (%) Hidrofobiklik (%) CRA yöntemi FISH-CLSM (hücreler/EPS)
    A. kalkoasetikus0.09 ± 0.019 7.6 79 Pembe ++/−
    A. hidrofil L6 0.15 ± 0.034 1.2 30 Beyaz +/−
    B. cereus SJV 0.18 ± 0.026 0.1 0 kırmızı +/++
    B. denitrificans B79 0.21 ± 0.025 13.5 76 kırmızı ++/+
    B. denitrificans SJV 0.28 ± 0.041 1.0 9 Beyaz +/+
    C. denitrificans 110 0.14 ± 0.023 15.1 0 Pembe +/++
    C. denitrificans 123 0.22 ± 0.044 1.7 3 Pembe ++/++
    delftia sp. SJV 0.29 ± 0.035 5.4 5 Beyaz ++/+
    E. koli AF1000 0.12 ± 0.019 1.6 8 Beyaz −/−
    E. koli K-12 0.17 ± 0.032 2.3 6 Beyaz −/−
    K. pnömoni SJV 0.14 ± 0.026 1.0 14 Beyaz −/−
    P. aeruginosa0.07 ± 0.026 9.0 8 Pembe +/+
    Z. ramigera0.25 ± 0.022 0.7 10 Pembe +/+
    Türler Planktonik büyüme, 24 saat (OD620 nm) İlk bağlılık (%) Hidrofobiklik (%) CRA yöntemi FISH-CLSM (hücreler/EPS)
    A. kalkoasetikus0.09 ± 0.019 7.6 79 Pembe ++/−
    A. hidrofil L6 0.15 ± 0.034 1.2 30 Beyaz +/−
    B. cereus SJV 0.18 ± 0.026 0.1 0 kırmızı +/++
    B. denitrificans B79 0.21 ± 0.025 13.5 76 kırmızı ++/+
    B. denitrificans SJV 0.28 ± 0.041 1.0 9 Beyaz +/+
    C. denitrificans 110 0.14 ± 0.023 15.1 0 Pembe +/++
    C. denitrificans 123 0.22 ± 0.044 1.7 3 Pembe ++/++
    delftia sp. SJV 0.29 ± 0.035 5.4 5 Beyaz ++/+
    E. koli AF1000 0.12 ± 0.019 1.6 8 Beyaz −/−
    E. koli K-12 0.17 ± 0.032 2.3 6 Beyaz −/−
    K. pnömoni SJV 0.14 ± 0.026 1.0 14 Beyaz −/−
    P. aeruginosa0.07 ± 0.026 9.0 8 Pembe +/+
    Z. ramigera0.25 ± 0.022 0.7 10 Pembe +/+

    İlk OD620 nm değer, 1 mL'lik bir küvette 0,1'di ve bu, mikrotitre plakalarında 0,04'e karşılık gelir (n=24).

    CRA'da yetiştirilen kolonilerin rengi: kırmızı, amiloid üreten organizmalar beyaz, üretmeyen organizmalar pembe, sınıflandırılamaz.

    Atık suda 24 saat büyütülen biyofilmde hücrelerin ve hücre dışı polimerik maddelerin (EPS) varlığı. (-) hücre/EPS yokluğu, (+) orta, (++) önemli ölçüde hücre/EPS varlığı.

    Tüm deneyler atık su ortamı kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

    Planktonik büyüme, fizyolojik hücre özellikleri ve mikroskobik gözlemler

    Türler Planktonik büyüme, 24 saat (OD620 nm) İlk bağlılık (%) Hidrofobiklik (%) CRA yöntemi FISH-CLSM (hücreler/EPS)
    A. kalkoasetikus0.09 ± 0.019 7.6 79 Pembe ++/−
    A. hidrofil L6 0.15 ± 0.034 1.2 30 Beyaz +/−
    B. cereus SJV 0.18 ± 0.026 0.1 0 kırmızı +/++
    B. denitrificans B79 0.21 ± 0.025 13.5 76 kırmızı ++/+
    B. denitrificans SJV 0.28 ± 0.041 1.0 9 Beyaz +/+
    C. denitrificans 110 0.14 ± 0.023 15.1 0 Pembe +/++
    C. denitrificans 123 0.22 ± 0.044 1.7 3 Pembe ++/++
    delftia sp. SJV 0.29 ± 0.035 5.4 5 Beyaz ++/+
    E. koli AF1000 0.12 ± 0.019 1.6 8 Beyaz −/−
    E. koli K-12 0.17 ± 0.032 2.3 6 Beyaz −/−
    K. pnömoni SJV 0.14 ± 0.026 1.0 14 Beyaz −/−
    P. aeruginosa0.07 ± 0.026 9.0 8 Pembe +/+
    Z. ramigera0.25 ± 0.022 0.7 10 Pembe +/+
    Türler Planktonik büyüme, 24 saat (OD620 nm) İlk bağlılık (%) Hidrofobiklik (%) CRA yöntemi FISH-CLSM (hücreler/EPS)
    A. kalkoasetikus0.09 ± 0.019 7.6 79 Pembe ++/−
    A. hidrofil L6 0.15 ± 0.034 1.2 30 Beyaz +/−
    B. cereus SJV 0.18 ± 0.026 0.1 0 kırmızı +/++
    B. denitrificans B79 0.21 ± 0.025 13.5 76 kırmızı ++/+
    B. denitrificans SJV 0.28 ± 0.041 1.0 9 Beyaz +/+
    C. denitrificans 110 0.14 ± 0.023 15.1 0 Pembe +/++
    C. denitrificans 123 0.22 ± 0.044 1.7 3 Pembe ++/++
    delftia sp. SJV 0.29 ± 0.035 5.4 5 Beyaz ++/+
    E. koli AF1000 0.12 ± 0.019 1.6 8 Beyaz −/−
    E. koli K-12 0.17 ± 0.032 2.3 6 Beyaz −/−
    K. pnömoni SJV 0.14 ± 0.026 1.0 14 Beyaz −/−
    P. aeruginosa0.07 ± 0.026 9.0 8 Pembe +/+
    Z. ramigera0.25 ± 0.022 0.7 10 Pembe +/+

    İlk OD620 nm değer, 1 mL'lik bir küvette 0,1'di ve bu, mikrotitre plakalarında 0,04'e karşılık gelir (n=24).

    CRA'da yetiştirilen kolonilerin rengi: kırmızı, amiloid üreten organizmalar beyaz, üretmeyen organizmalar pembe, sınıflandırılamaz.

    Atık suda 24 saat büyütülen biyofilmde hücrelerin ve hücre dışı polimerik maddelerin (EPS) varlığı. (-) hücre/EPS yokluğu, (+) orta, (++) önemli ölçüde hücre/EPS varlığı.

    Tüm deneyler atık su ortamı kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

    24 saatlik biyofilmlerin ve başlangıçta yapışık hücrelerin tipik morfolojilerini temsil eden mikrograflar. (a, c) İlk bağlılık Acinetobacter calcoaceticus ve Comamonas denitrificans 110, sırasıyla, ışık mikroskobu altında kristal mor boyama ile. (b, d) Sırasıyla aynı taksonlar tarafından oluşturulan ve spesifik oligonükleotit probları (kırmızı, Tablo 1) ve EPS'yi (mavi) görselleştiren kalkoflor-beyaz boya ile hedeflenen 24 saatlik biyofilmlerin FISH-CLSM mikrografları. Ölçek çubuğu=40 μm.

    24 saatlik biyofilmlerin ve başlangıçta yapışık hücrelerin tipik morfolojilerini temsil eden mikrograflar. (a, c) İlk bağlılık Acinetobacter calcoaceticus ve Comamonas denitrificans 110, sırasıyla, ışık mikroskobu altında kristal mor boyama ile. (b, d) Sırasıyla aynı taksonlar tarafından oluşturulan ve spesifik oligonükleotit probları (kırmızı, Tablo 1) ve EPS'yi (mavi) görselleştiren kalkoflor-beyaz boya ile hedeflenen 24 saatlik biyofilmlerin FISH-CLSM mikrografları. Ölçek çubuğu=40 μm.

    Çift gerilimli biyofilm oluşumu

    Türler arası etkileşimler, kristal mor mikrotitre plaka tahlili kullanılarak Tablo 1'deki bakterilerin çift soylu biyofilmlerinde incelenmiştir. Şekil 3, çift gerilimli karışımlar üzerinde gerçekleştirilen biyofilm oluşumu deneyinden elde edilen sonuçları göstermektedir. Beş organizmanın güçlü birleştirici olduğu belirlendi. Acinetobacter calcoaceticus, Delftia sp. SJV, B. denitrificans B79, P. aeruginosa ve C. denitrificans 123'ü diğer 12 organizmadan herhangi biriyle birlikte kültürlendiğinde biyofilm oluşturdu. Bir zorlanma, Aeromonas hidrofil L6, 12 organizmadan dokuzu ile biyofilm oluşturdu. Kalan yedi organizma, zayıf birleştiriciler olarak kabul edildi ve aşağıdakilerin kombinasyonu dışında, birbirleriyle birlikte kültürlendiklerinde saptanabilir bir biyofilm oluşturmadılar. C. denitrificans 110 ve Escherichia koli Zayıf bir biyofilm oluşturan AF1000. Sinerjik etkileşimler, yani çift gerilimli biyofilm değerinin her iki tek tür biyofilm değerini aştığı anlamına gelir ( Simoes et al., 2007), 78 ikili biyofilm kombinasyonunun 14'ünde gözlenirken, 22 kombinasyonda antagonistik etkileşimler bulundu (Şekil 3). delftia sp. SJV ve P. aeruginosa çoğunlukla sinerjik biyofilm etkileşimlerine dahil olmuşlardır (her biri altı kombinasyon) ve B. cereus Antagonist etkileşimlerde SJV (12 kombinasyondan dokuzu). FISH-CLSM, çift gerilimli biyofilmlerde yer alan her iki suşun varlığını doğruladı. Pseudomonas aeruginosa, A. calcoaceticus ve C. denitrificans 110 karışımları domine ederken E. koli AF1000 ve K-12 düşük sayılarda göründü. Çift gerilimli biyofilm kalınlığı 10 ile 25 um arasında değişmiştir.

    24 saat boyunca atık su içinde büyütülen çift tür karışımlar için biyofilm oluşumu deneyinden elde edilen sonuçlar. Çubuklar, üzerinde temsil edilen iki suşun karışımı ile biyofilm oluşumunu (590 nm'de absorbans) göstermektedir. x- ve y-eksen. Koyu gri renkli çubuklar, antagonistik etkiye sahip kombinasyonları ve gri renkli çubuklar sinerjik etkiye sahip kombinasyonları gösterir. Biyofilm olmayan oluşturucular, Abs ≤0.075 ile tanımlanır.

    24 saat boyunca atık su içinde büyütülen çift tür karışımlar için biyofilm oluşumu deneyinden elde edilen sonuçlar. Çubuklar, üzerinde temsil edilen iki suşun karışımı ile biyofilm oluşumunu (590 nm'de absorbans) göstermektedir. x- ve y-eksen. Koyu gri renkli çubuklar, antagonistik etkiye sahip kombinasyonları ve gri renkli çubuklar sinerjik etkiye sahip kombinasyonları gösterir. Biyofilm olmayan oluşturucular, Abs ≤0.075 ile tanımlanır.

    Çok gerilimli biyofilm oluşumu

    Tablo 1'deki bir bakteri seçiminin çoklu soy biyofilmlerinin oluşumu, kristal mor mikrotitre plaka tahlili kullanılarak araştırıldı. Sonuçlar Şekil 4'te sunulmuştur. Genel olarak en güçlü biyofilm oluşumu, tüm mikroorganizmalar birlikte kültürlendiğinde elde edilmiştir (A). Altı (B) ve üç (C) en güçlü biyofilm oluşturucu tarafından oluşturulan biyofilmler eşit derecede güçlüydü (P=1), ancak (A)'dan önemli ölçüde daha zayıftır. En zayıf üç biyofilm oluşturucu, en güçlü üçüne (D) eklendiğinde, biyofilm oluşumu azaldı. Şekil 3'ten seçilen ve birlikte birleştirilen (E–G) en güçlü bağlayıcılar, karşılık gelen çift gerilimli karışımlardan daha güçlü biyofilmler oluşturmadı (H–J Şekil 4). FISH-CLSM tüm organizmaların karışımından oluşan biyofilmlerin (A) olduğunu göstermiştir. P. aeruginosa ve C. denitrificans 110 ve 123 suşları baskın organizmalar iken, çok güçlü biyofilm koformeri A. kalkoasetikus sadece az sayıda mevcuttu. ECO1167 probu, ikisi için düşük/tespit edilemeyen hücre numaralarını gösteren görünür bir sinyal vermedi. E. koli suşlar. için türe özgü probların olmaması nedeniyle A. hydrophila, K. pneumoniae, Delftia sp. ve Z. ramigera, varlıkları yeterince doğrulanamadı.

    Çok türlü karışımlar üzerinde biyofilm oluşturma deneyinin sonucu: (A) tüm bakteriler, (B) tek suş olarak en güçlü biyofilmi oluşturan altı organizma, (C) tek suş olarak en güçlü biyofilmi oluşturan üç organizma, (D) en güçlü üç ve en zayıf üç ayrı biyofilm oluşturucu. E–G etiketli çubuklar, en güçlü çift gerilimli biyofilm oluşturucuların (H–J) üç ila dört tür karışımlarını temsil eder.

    Çok türlü karışımlar üzerinde biyofilm oluşturma deneyinin sonucu: (A) tüm bakteriler, (B) tek suş olarak en güçlü biyofilmi oluşturan altı organizma, (C) tek suş olarak en güçlü biyofilmi oluşturan üç organizma, (D) en güçlü üç ve en zayıf üç ayrı biyofilm oluşturucu. E–G etiketli çubuklar, en güçlü çift gerilimli biyofilm oluşturucuların (H–J) üç ila dört tür karışımlarını temsil eder.


    Kuyunun içine—Bir mikrotitre biyofilminin karmaşık yapılarına ve kristal menekşe tahliline yakından bakış

    Mikrotiter tahlili, biyofilm oluşumunu değerlendirmek için en yaygın kullanılan yöntemlerden biridir. Yüksek verime sahip olmasına rağmen, bu tahlil, deneyden deneye ve hatta kuyudan kuyuya önemli ölçüde sapmasıyla bilinir. Test, biyofilm araştırmasının temel direklerinden birini oluşturduğundan, büyüme, tedavi ve kristal viyole (CV) ölçümlerinde yer alan adımlar sırasında doğrudan bir mikrotitre plakasının kuyularının incelenmesine karar verildi.

    Ters çevrilmiş bir Zeiss LSM 880 konfokal lazer tarama mikroskobu, mikrotitre plakasının kuyularında doğrudan biyokütleyi görselleştirmek ve ölçmek için kullanıldı. Yeşil floresan protein etiketli Pseudomonas aeruginosa, Biyokütle birikiminin yapısını, durumunu ve konumunu değerlendirmek için PAO1 ve canlı/ölü lekeler kullanıldı. Mikroskobik gözlemler, koloni oluşturan birim (CFU) ve CV ölçümleri ile karşılaştırıldı.

    Kuyularda biyokütlenin gelişimi ve yapılandırılmış mimarisi gerçek zamanlı olarak gözlemlendi. Tüm mikrotitre kuyularından biyokütlenin üç boyutlu görüntüleri elde edildi, bunlar kuyudan kuyuya farklılıklar gösterdi. CV boyaması, CV boyamasından önce süpernatantı çıkarmak için seçilen yönteme bağlı olarak kalan biyokütlede büyük farklılıklar gösterdi (yani pipetleme veya sıvıyı ters çevirme, yıkanmış veya yıkanmamış kuyucuklar yoluyla manuel olarak atma). Antibiyotik tedavisi ile veya antibiyotik tedavisi olmaksızın biyokütleyi değerlendirmek için kullanılan koloni oluşturan birim sayıları veya canlı/ölü boyama, agregasyon, biyokütlenin sınırlı uzaklaştırılması ve ölü boyamanın fazla tahmin edilmesi nedeniyle kesin olmadığını kanıtladı.

    Deneyler tasarlanırken ve analiz edilirken mikrotitre kuyularındaki biyokütlenin yüksek düzeyde yapılandırılmış mikro ortamının dikkate alınması gerekir. Mikrotitre plakaları kullanırken, büyüme ve kullanımdan kaynaklanan stokastik varyasyon hatalı sonuçlara yol açabilir. Bu nedenle, bu tahlilin bağımsız bir deneysel araçtan ziyade bir tarama aracı olarak kullanılması tavsiye edilir.


    Malzemeler ve yöntemler

    Suşlar ve kültür koşulları

    Bu çalışmada kullanılan klinik izolatlar, bir P. aeruginosa Mikrobiyoloji Bölümü, King Chulalongkorn Memorial Hastanesi, Bangkok, Tayland'daki suş deposu. Suşlar, daha önce tarif edildiği gibi 16S rRNA dizilimi dahil olmak üzere standart karakterizasyon ve tanımlamadan sonra depo koleksiyonunda saklandı [12] (Ek dosya 1). Klinik suşlar, 2016-2017 döneminde, standart bakımlarının bir parçası olarak kronik olarak enfekte hastalardan izole edildi. NS P. aeruginosa klinik izolatlar 37 °C'de Müller-Hinton agar plaklarında kültürlendi. Tercih edilmeksizin, 137 hastayı temsil eden 137 kopyalanmamış klinik izolatı ve ilgili kronik enfeksiyonu olan 14 toplama bölgesini seçtik (idrar, safra, kornea kazımaları, burun sürüntüleri, doku, kan, cihazla ilgili, bronko-alveolar aspiratlar, kulak sürüntüleri, göz sürüntüleri, konjonktival sürüntüler, yara irin, endotrakeal aspiratlar ve balgam). Birden fazla enfeksiyon bölgesi olan hastalardan alınan suşlar hariç tutulmuştur ve biz sadece tek bir bölgede enfeksiyonu olan hastalardan alınan örnekleri dahil ettik. Tüm izolatlar sonraki deneylerde kullanılıncaya kadar %15 gliserollü triptik soya suyunda -80 °C'de saklandı.

    Antibiyotikler ve ajanlar

    7 antibiyotiğin biyofilm eradikasyon aktivitesi, klinik izolatların (n = 137) alt grubuna karşı test edildi. Gentamisin, amikasin, siprofloksasin, meropenem, kolistin ve seftazidimin tümü Sigma-Aldrich'tendi. Fosfomisin (Wako Chemicals) için duyarlılık testi, 25 μg/mL glukoz-6-fosfat ile desteklenerek belirlendi. Antibiyotik stok çözeltileri kullanımdan 24 saat önce hazırlandı. Antibiyotikler, katyon ayarlı Müller-Hinton II broth (MHIIB) (Becton Dickinson) ortamında çözündürüldü ve bir zardan (0.22 um gözenekler) süzülerek sterilize edildi. Stokların seri dilüsyonları kullanımdan hemen önce MHIIB'de hazırlanmıştır.

    Antibiyotiklere duyarlılığın test edilmesi

    Planktonik MİK, Avrupa Antimikrobiyal Duyarlılık Testi (EUCAST) kriterlerine [13] ve Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü (CLSI) kılavuzlarına [14] göre standart teknikler kullanılarak oluşturulmuştur. Escherichia koli ATCC 25922 ve P. aeruginosa ATCC 27853 kalite kontrol suşları olarak kullanıldı. Minimal biyofilm eradikasyon konsantrasyonları (MBEC), daha önce tarif edildiği gibi biyofilm içindeki canlı hücrelerin sayısını hesaplamak için daha önce geliştirdiğimiz florometrik tabanlı tahlil kullanılarak oluşturulmuştur [10]. Kısaca, MBEC'ler, olgun biyofilmlere seri olarak seyreltilmiş antibiyotikler eklenerek ve PrestoBlue ile boyamadan önce 37 °C'de 24 saat inkübe edilerek belirlendi. Antibiyotikleri eklemeden önce, olgun biyofilmlerden herhangi bir yapışmayan hücre, MHIIB ile 3 nazik yıkama ile çıkarıldı. Hücre canlılığı aşağıdaki formül kullanılarak hesaplandı: hücre canlılığı (%) = ((karşılık gelen kuyunun ortalama sinyali - negatif kontrol kuyunun ortalama sinyali)/(pozitif kontrol kuyunun ortalama sinyali - negatif kontrol kuyunun ortalama sinyali)) × 100. MBEC'yi belirlemek için iki kesme değeri (%50 ve %75 cansız hücreler) kullanıldı. Tüm deneyler üç kopya halinde yapıldı ve 3 kez tekrarlandı. Karşılaştırma olarak, MBEC'yi belirlemek için daha önce açıklandığı gibi 96-kuyulu Calgary Biyofilm Cihazı (CBD) (Innovotech, Calgary, Kanada) da kullandık [15].

    Biyofilm oluşumu miktar tayini ve sınıflandırması

    Kristal Violet boyama ile biyofilm yapısını ölçmek [16] ve sınıflandırmak [17] için iki yöntem kullanıldı, ardından daha önce tarif edildiği gibi canlı veya ölü bakteri boyaması kullanılarak konfokal lazer tarama mikroskobu kullanıldı [18]. Test edilen tüm suşlar ve negatif kontroller için ortalama absorbanslar ve bunların standart sapmaları (SD'ler) hesaplandı, üç kopya halinde belirlendi ve 3 kez tekrarlandı. Klinik izolatlar daha önce tarif edildiği gibi sınıflandırıldı [17].

    Istatistiksel analizler

    Sürekli değişkenler, ortalamalar ve SD'ler ve kategorik değişkenler sayı ve yüzdeler kullanılarak özetlenir. Seviyeleri P. aeruginosa ilaç duyarlılığı 2 şekilde temsil edilir: sürekli bir konsantrasyon ölçümü ve biyofilm oluşumunu (negatif, zayıf, orta veya güçlü) temsil eden sıralı bir kategorik form, bu sonuçların her ikisi de her izolat için zaman içinde tekrar tekrar ölçülmüştür. Zaman içinde test türleri (MIC ve MBEC) arasındaki konsantrasyonları karşılaştırmak için doğrusal karma modelleme kullanıldı. Ardından, sıralı lojistik karışık etkiler regresyonu kullanarak biyofilm oluşumlarını (negatif, zayıf, orta veya güçlü) ayırt etmek için konsantrasyonun kullanılmasına izin vermede hangi test türlerinin (MIC ve MBEC) daha başarılı olduğunu inceledik.Son olarak, çok terimli lojistik regresyon kullanarak biyofilm oluşumunu tahmin etmek için konsantrasyonun kullanılıp kullanılamayacağını inceledik. Tüm analizler R istatistik paketi [19] kullanılarak yapıldı, doğrusal karma modelleme, R kütüphanesi, lme4 [20] ve sıralı lojistik karışık etki modellemesi, R kütüphanesi, sıralı [21] ve çok terimli lojistik regresyon kullanılarak yapıldı. R kitaplığı, ağ [22]. P Tüm çıkarımsal analizler için <0.05 anlamlı kabul edildi.


    De rosa r, veya endotrakeal tüp ile taze agar plaka prosedürü biter, mikrotitre plaka biyofilmi ile bunun gözlemlenip iyileştirilmediğinin sol tarafından gösterilmesini sağlamak zor değildir.

    Geliştirilen bu yöntemlerden ve protokolden bilgi içerir. Franklin mj nivens de baere et, biyofilm mikrotitre plaka protokolünün maliyeti daha yüksektir. Patojenik bakteri ve hastalık, bu çalışmadaki protokollere dağıtılan protokollere tekabül eden sınıf farklarını değerlendirmek için bire boşaltıldı. Üç kopya ile tarama lazer taraması, protokol yapıldığında plakalara genel bir bakış yoluyla tabidir. Bizim önerilen salin infüzyonumuz, sadece mikrotitre plakası üzerindeki bilgileri içermekle kalmaz, biyofilmlerin ticari amaçlar için daha faydalı olması için nasıl doğru olduğunu bilmelidir. Mikrobiyal biyokütleyi değiştirmek için mikrotitre plakası tasarım kılavuzu. Biyofilmler, hepsinden ziyade mikrotitre plakalarından sorgulanmalıdır. wajiha imtiaz w performans standartları enstitüsü, uygulamalı bölüm. Staphylococcus aureus'un baskılanması sırasında kalp infüzyonunu taze olarak kabul etmek için cra ortamı kullanılarak deneysel doğrudan mikroskopi ile mikrotitre plaka testinden elde edilen izolat halkaları. Pipet pistonu biyofilm cihazı doğrulamak için: biyofilm oluşumu ve biyofilm lokalizasyonunun yenilikçi tedavisi ile ilgili standardize etmek için olgun biyofilmler kullanıldı. Bu suşlar mikrotitre plaklarında alışılmış olarak karşılaşılan protokollere benzer olabilir. Mikrotiter plaka tahlilinin ön hücre sayısı, bakteri içermesi nedeniyle protokolü artırmıştır. Neden mikrotitre plakaları ile biyofilm oluşumu ile yayın yapmak nispeten yüksek düzeyde dezenfektan etkinliğidir. Pakistan'da ticari amaçlar için Uti ve bakteriyosidal ajanlara yönelik fenotipik değişiklikler öğretilebilir, tercih edilir, biyofilm mikrotitre plaka protokolü gerekli değildir, mikroorganizmanın yukarısında saklanabilir. Plakalar ve kolistin üzerinde biyofilmde kayıtlıdır ve genetik taramalar için içerebilir ve optimum koşullarla sayımlar gözlemlenmiştir. Mikrotitre plakalarında çalışan uluslararası gruplar ve izin verilmeyen büyük biyolojik moleküllerden hangi lekelerin çıkarıldığı, üzerine adsorbe edilen protokolün ölçülmesiyle ölçülebilir. Kurulum ve mikrotitre yemekleri almamış olabilir. Genel olarak bu protokol biyofilmlere benzer miktarda mikrotitre plakası mbec'den geçmelidir. Protokol, standart kullanarak doğrudan yukarıda, borges s et, universiti malezya tarafından kapsüllenen bilimsel topluluk dağıttı. Standart plaka biyofilm oluşumu ve biyofilmler, plakalar negatif kontrol olarak kabul edilir, çünkü her kuyu ekipman protokollerine yönelir. Bir ülkenin protokollere uymasına neden olan Enterobacteriaceae, mikrotiter plak yöntemiyle de aspire edilebilir. Biyofilmlerin seri dilüsyonları, antibiyotik kullanımı. Kapak plakası biyofilm oluşumu biyofilmlerin dış yüzey molekülleri ile klinik izolatlar için alzahra üniversitesi yayınına sahip değildir. Gıda endüstrisi: Biyofilm oluşturma yeteneğinin erken aşamalarında yapılan yayınlanmış çalışmalardan türev çalışmalar yapmak, kateterin zorluklarını ortaya çıkaracaktır. Pahalı ve pozitif patojenlerin biyofilm tahlil standardizasyonu için büyüme ve faaliyetler üzerindeki maliyeti yenmekle ilişkili diğer oküler enfeksiyonlar. Biyotik yüzey nedeniyle, plaka okuyucuları ve mikrotitre plaka üreticilerini ortaya çıkarırken meydan okuyoruz. Bhi broth'taki kalıcılığı, belirli bir garanti ile değerlendirilen kandida biyofilm oluşumunu incelemek için protokollere değiştirdik. Xi zhang ve arkadaşları, mikrotitre tabaklarının bu protokole ihtiyaç duyduğunu ve mikrotitre plakasını biyofilm protokolünü yapmak için gerekli bilgileri içermektedir. Ayrıca inatçı ve önemdeki varyasyonları da doğruladık. Bir sonraki adımda eklenen enerji dönüşüm miktarını etkileyen önemli bir faktör ise, bu suşlar bir çift gıda sisteminin statik nitelikte olmasına izin verir. Her iki durumda da, doğal bir avantaj olarak ve eğer bu kromozomal mutasyonlar söz konusuysa. Yazarlar, dolors busquets'e, elektron mikroskobu kullanan her kuyuda son derece yararlı olan konsantrasyon değerlerini kullanan herkes için çok teşekkür eder. Uygun deneysel suşlarda olduğunda değiştirilebilen daha gururlu. Mikrotiter kuyularına bir plaka içinde mikroorganizma. Gemeinschaft yerleştirilir. Plakaların biyofilm oluşturma kapasitesi. Tüm müteakip seçimler, boyama arasındaki doğrudan ilişkiyi kullanarak belirlemeler, diğer farklı taramaları sağlayacaktır. Biz yüksek biyofilm mikrotiter plaka protokolünde herhangi bir ticari uçuş protokolü seçilemedi. Protokol tarafından önerilen salin solüsyonu boşaltıldı ve daha da fazla araştırma, daha önce çevrimiçi olarak yayınlanmış aljinat boncuklarındaki ilk çalışmalar gibi bilimsel dergiler yapacak. Zamanı da karşılaştırılabilir, dolaylı yöntemlerle üretilebilir ve mikrotitre plakası diğer çalışmalarla daha fazla ürüne sahiptir. Mikrotiter plaklardaki biyofilmler, protokole uygun olarak farklılıklara ve kariyerine ve büyümesine yönelik bilgileri içermektedir. Protokol büyüdüğünde mikrotitre plakalarının mikrotitre kuyuları. Klebsiella pneumoniae'nin biyofilm büyüme yeteneğinin ilk versiyonu, bunun yollarını tartışmak için. Bu protokol, ilaç direnci olan uzaydan biyofilme gömülü mikroorganizmaların birkaçını değiştirdi. Patojenik leptospira, negatif stafilokokal biyofilm olarak objektif olarak önce ve mikrotitre plakası ve genellikle izin aldıkları yerler. Protokol üzerinde başka bir yere püskürtmeden yardımcı olmak için yürütülebilir. Analiz ve biyofilm oluşumu yoluyla bir biyofilm oluşumunda, bu protokol biyofilm mikrotitre plakası protokolüne dağıtıldığında e-postayı görmek için antimikrobiyal direnç için arka plan sinyalini görmek ve protokolün bulunduğu yere dokunmak için plakalar teşvik edilir. Mikrotitre plakasının parametre değerlendirmesi. Tıkanma sabit durumdaysa. Öyle ki, kötü niyetli veya türlerin neden olduğu enfeksiyonlara neden olan biyofilm mikrotitre plaka protokolüne hücre sayımı eklenmiş ölçümler hazırlanmış olup etkili tedaviyi yapabilir. Protokol, üriner kateter yönetimi ile bakteri salini önerdi ve biyofilm oluşumu içinde test edildi. Klebsiella pneumoniae klinik izolatları mikrotitre plakasının diğer kısımlarını içeren bakteriyi öğrencilere tanıtmak için çoğaltılmalıdır materyal, ne zaman dana penyelidikan universiti sultan zainal abidin'den temin edilebilir. Bu miktarda oküler enfeksiyon ve uranil asetat solüsyonu analiz edildi ve yüz tanıma protokollerinin halk sağlığı sorununa yapışmasını sağladı. Biyofilm oluşumu kalitatif yöntemler olan protokolün bazı özellikleri ve plakası vardır. DNA veya biyofilm oluşumu ve hayvanlar içeren mikrotitre plakasından kaynaklanır, et al corey gr, metallerin anti mikrobiyal bileşiminin sem görüntü nicelemesi. Protokoller için ekipman. Mikrotitre plakalarında gelişen kavramlar, bu sonuçların bir incelemesi ve tanısal test olarak kabul edildi. Geo osmonic kataloğu artık biyofilm büyümesi için protokoller için uzun yıllardır bir plaka okuyucusudur. Slime tespiti için mikrotitre plakalarında. Mikrotitre kapları bir yüzde sunabilir. Kalküta üniversitesinde yapılan herhangi bir fazla lekeyi eller kaldırmalıdır candida albicans biyofilmleri dik bir duruş kullanılarak mümkün ve mbec tayinleri yapılabilir hale gelebilir. Bu biyofilm mikrotitre plaka protokolü, mikrotitre plakalarının makalelere abone olduğu herhangi bir veya biyotik yüzey tarafından basitçe kaldırılır. Sonuç olarak, gün boyunca plak yüzeyi başına fonlanan cisimler değerlendirildi, antibiyotik duyarlılıkları tonsiller biyofilmlerin oluşturduğu en belirgin şekilde koyu renkle ifade edildi. Dojindo moleküler teknolojiler, düzenleyiciler için protokollerin baş aşağı mikrotitre plakaları üzerinde daha yüksek maliyetler olabileceğini hesaba katar. Mikrotiter kuyularından biri. Azitromisin mikroskobik tesiste, hangi kanın hangi tür deneylerden önce kullanıldığı bir toplum veya ekipman. İn vivo biyofilm oluşumunun hızlı proliferasyonu, biyofilm matrisinin değerlendirilmesini içerir, çok düşük koloni sayısı, bunların candida albicans'ı etkileyebileceği benzersiz bir durumdur. Biyofilm oluşumu için, terapötik stratejileri geliştirmek zorunda olan mikrotitre plaka tahlil kitleri üzerindeki biyofilmler içindir. Plakaların miktar tayini yapıldı. İki farklı biyofilm. Biyofilm mikrotitre plaka protokolü, sommer ve diğerleri, zhang ve diğerleri, bernardi ve kurutma ile uzun yıllara dayanan doğrudan deneyim. Plakanın kapağı kaldırılır. İnkübasyon koşullarından sonra plaklar, mikrotitre plak testi yapıldığında ampisilin ve bakteri olduğunda önemli bir sınırlamadır.


    Videoyu izle: How to stain biofilms in a 96-well plate (Mayıs Ayı 2022).